蛋白質(zhì)是生命的基石，其功能由其獨(dú)特的氨基酸序列決定。然而，自然界中常規(guī)遺傳密碼僅允許 20 種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的整合，這對蛋白質(zhì)功能的多樣性構(gòu)成了一定限制?；蛎艽a子擴(kuò)展（Genetic Code Expansion, GCE）技術(shù)突破了這一限制，為蛋白質(zhì)中引入非天然氨基酸（ncAAs）提供了一種革命性的方法。

通過引入特定的正交氨酰-tRNA 合成酶（aaRS）/tRNA 對，GCE 技術(shù)可以在細(xì)胞中特定位點插入 ncAAs，而不影響內(nèi)源性翻譯過程。近年來，研究者通過優(yōu)化 aaRS/tRNA 系統(tǒng)、改進(jìn)翻譯機(jī)制以及開發(fā)新的篩選技術(shù)，使 GCE 技術(shù)在合成生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用潛力。

近日，北京大學(xué)劉濤團(tuán)隊和深圳先進(jìn)院羅小舟團(tuán)隊合作發(fā)表最新綜述：“Genetic Code Expansion: Recent Developments and Emerging Applications”，發(fā)表在期刊 Chemical Reviews 上，并被選為期刊封面。

到目前為止，已有 200 多種 ncAAs 通過 GCE 技術(shù)被定點整合到蛋白質(zhì)中。這篇文章從系統(tǒng)層面詳細(xì)概述了 GCE 的現(xiàn)狀以及面臨的挑戰(zhàn)與機(jī)遇，并重點論述了其在合成生物學(xué)、生物機(jī)制研究和新型治療等前沿領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。

GCE 通過引入新的“編碼單元”擴(kuò)展蛋白質(zhì)的化學(xué)功能，為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)帶來新的可能性。其核心機(jī)制是利用正交化的 aaRS/tRNA 對，aaRS 將特定的 ncAAs 連接到 tRNA上，指導(dǎo)它們在翻譯中整合到蛋白質(zhì)中，從而不干擾宿主細(xì)胞的天然蛋白質(zhì)合成。

通過優(yōu)化 aaRS/tRNA 對，GCE 技術(shù)從最初的原核生物擴(kuò)展到真核生物系統(tǒng)，甚至應(yīng)用于多細(xì)胞生物，如線蟲和小鼠。其廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)工程、藥物開發(fā)、疫苗生產(chǎn)和基因編輯等領(lǐng)域，為設(shè)計新型酶、開發(fā)更有效的藥物和疫苗、以及精準(zhǔn)基因編輯提供了新的工具。GCE 技術(shù)為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)帶來了革命性變化，開辟了探索生命奧秘和開發(fā)治療方法的新途徑。

GCE 技術(shù)的發(fā)展快速得益于對核心組件的持續(xù)優(yōu)化，包括 aaRS、tRNA 和其他翻譯系統(tǒng)組件，以及 ncAAs 的合成與供應(yīng)。近年來，科學(xué)家們在這些方面取得了顯著的進(jìn)展。

除了傳統(tǒng)的篩選和優(yōu)化方式，研究人員們通過探索極端生物，特別是嗜熱生物，以尋找更穩(wěn)定和易于修改的 aaRS/tRNA 對。例如從嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus） 中鑒定出一類新的酪氨酸 tRNA 合成酶 （TyrRS）/tRNATyr 對表現(xiàn)出優(yōu)異熱穩(wěn)定性，并在哺乳動物和釀酒酵母中都表現(xiàn)出正交性；此外，將 aaRS 和它們相應(yīng)的 tRNAs 與完全不同的 aaRS/tRNA 對融合，以開發(fā)新型的正交 aaRS/tRNA 對。

針對 tRNA，通過增加 tRNA 的拷貝數(shù)、優(yōu)化 tRNA 與翻譯組件之間的相互作用等方法可以提高 ncAA 的引入效率；對 tRNA 進(jìn)行修飾也可以影響其抑制效率和特異性。這些方法和技術(shù)的發(fā)展將有助于進(jìn)一步推動人工合成生物學(xué)的發(fā)展。

除了 aaRS 和 tRNA，翻譯系統(tǒng)的其他組分也進(jìn)行了優(yōu)化，包括引入新的密碼子、開發(fā)正交核糖體、降低靶 mRNA 降解等策略。

通過設(shè)計正交核糖體，科學(xué)家們創(chuàng)建了只翻譯帶特定結(jié)合位點的 mRNA 的核糖體，完全隔離了天然翻譯系統(tǒng)，從而實現(xiàn)了更高效的 ncAAs 整合；通過刪除或突變釋放因子 RF1，研究者顯著提高了 UAG 密碼子用于 ncAAs 整合的效率。

為了解決 ncAAs 供應(yīng)問題，研究人員通過代謝通路重構(gòu)，成功實現(xiàn)了多種 ncAAs 的生物合成。例如，在大腸桿菌中，通過引入對羥基苯丙氨酸（pHPhe）的合成途徑，實現(xiàn)了高產(chǎn)量生產(chǎn)；通過基因敲除和關(guān)鍵酶的調(diào)控，顯著減少了副產(chǎn)物生成，提高了 ncAAs 的純度。

通過這些優(yōu)化，GCE 技術(shù)實現(xiàn)了更高效、更精確的翻譯體系，不僅提升了系統(tǒng)的穩(wěn)定性，還拓展了 GCE 技術(shù)的應(yīng)用潛力。未來，隨著更多 ncAAs 的合成和翻譯工具的開發(fā)，GCE 技術(shù)將在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

圖 | 通過融合不同的 aaRS/tRNA 對來創(chuàng)建嵌合酶，提高了活性或穩(wěn)定性（來源：上述論文）

GCE 技術(shù)已經(jīng)從實驗室的工具逐步走向應(yīng)用，在合成生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、機(jī)制研究和新材料開發(fā)等領(lǐng)域展現(xiàn)了廣泛的潛力。

GCE 技術(shù)為基因調(diào)控工具的開發(fā)提供了新思路。例如，利用光響應(yīng)型 ncAAs 構(gòu)建的光控基因回路，能夠在細(xì)胞中實現(xiàn)時間和空間精確調(diào)控；化學(xué)響應(yīng)型 ncAAs（如對某些化學(xué)分子敏感的修飾氨基酸）用于開發(fā)對外源分子敏感的開關(guān)蛋白。GCE 技術(shù)推動了蛋白質(zhì)工程的深度發(fā)展，包括：在天然酶的活性中心引入 ncAAs 以提升催化效率，例如通過加入磷酸化氨基酸來增強(qiáng)底物特異性；在結(jié)構(gòu)蛋白中整合氟化修飾的 ncAAs，提高熱穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度。

GCE 技術(shù)在疫苗設(shè)計中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在抗原優(yōu)化上。通過引入具備穩(wěn)定性和增強(qiáng)免疫反應(yīng)能力的 ncAAs，研究者成功開發(fā)了可自組裝的納米疫苗。例如用于 HIV 疫苗研發(fā)的光交聯(lián)型氨基酸顯著提升了免疫反應(yīng)強(qiáng)度；在 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)中引入具有化學(xué)修飾功能的 ncAAs，使其更加穩(wěn)定和特異，降低了脫靶風(fēng)險。這為精準(zhǔn)基因編輯提供了更安全高效的選擇。

利用熒光活性或化學(xué)活性 ncAAs 標(biāo)記特定蛋白，科學(xué)家能夠?qū)崟r追蹤細(xì)胞內(nèi)信號通路。例如，光活性 ncAAs 被用于研究 Ras 蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，為癌癥相關(guān)機(jī)制提供了新見解。通過在酶的活性中心引入金屬結(jié)合位點的 ncAAs，研究者成功模擬了復(fù)雜的金屬酶催化反應(yīng)，為理解氧化還原酶的分子機(jī)制提供了理論支持。

GCE 技術(shù)支持功能化生物材料的設(shè)計，例如：在蛋白質(zhì)中引入雙鍵功能的 ncAAs，用于構(gòu)建具有高韌性和抗菌性能的水凝膠；通過整合生物正交反應(yīng)位點，開發(fā)了可控釋放藥物的生物膜材料；利用電化學(xué)活性或熒光標(biāo)記的 ncAAs，研究者開發(fā)了高靈敏度生物傳感器：實時檢測水中重金屬離子或有機(jī)污染物的傳感器已被應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測；用于癌癥早期診斷的蛋白質(zhì)生物傳感器，通過標(biāo)記癌癥相關(guān)標(biāo)志物，顯著提升了檢測特異性。

圖 | 基因表達(dá)調(diào)控（來源：上述論文）

GCE 技術(shù)作為合成生物學(xué)的重要突破，正在加速基礎(chǔ)科學(xué)研究與實際應(yīng)用的發(fā)展。

GCE 技術(shù)的進(jìn)展主要得益于對翻譯組件（如 aaRS/tRNA 系統(tǒng)、核糖體）的優(yōu)化及非天然氨基酸（ncAAs）的應(yīng)用。目前，GCE 技術(shù)已在多種生物模型中展示了強(qiáng)大的適用性，優(yōu)化的正交 aaRS/tRNA 對和核糖體工程提高了 ncAAs 的整合效率和翻譯精度，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)功能拓展和生物醫(yī)學(xué)。然而，GCE 技術(shù)仍面臨提升翻譯效率、降低 ncAAs 生產(chǎn)成本及解決生物安全和倫理問題的挑戰(zhàn)。未來，GCE 技術(shù)將結(jié)合正交核糖體和四聯(lián)體密碼子技術(shù)，開發(fā)功能復(fù)雜的蛋白質(zhì)，并借助人工智能和高通量技術(shù)提高設(shè)計效率。同時，技術(shù)將在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和綠色催化劑等領(lǐng)域的應(yīng)用中發(fā)揮更大作用，推動可持續(xù)發(fā)展。

總的來說，GCE 技術(shù)為生命科學(xué)研究和應(yīng)用提供了新的視角，展現(xiàn)了巨大潛力，隨著技術(shù)的進(jìn)步，未來將在科學(xué)研究和實踐中發(fā)揮重要作用。

參考鏈接：

1.Huang Y, Zhang P, Wang H, et al. Genetic Code Expansion: Recent Developments and Emerging Applications[J]. Chemical Reviews, 2024.

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