SPLICER: a highly efficient base editing toolbox that enables in vivo therapeutic exon skipping 作者：Miskalis, Angelo, Shirguppe, Shraddha, Winter, Jackson, Elias, Gianna, Swami, Devyani, Nambiar, Ananthan, Stilger, Michelle, Woods, Wendy S., Gosstola, Nicholas, Gapinske, Michael, Zeballos, Alejandra, Moore, Hayden, Maslov, Sergei, Gaj, Thomas, Perez-Pinera, Pablo Nature Communications：2024/11/28
Exon skipping technologies enable exclusion of targeted exons from mature mRNA transcripts, which have broad applications in medicine and biotechnology. Existing techniques including antisense oligonucleotides, targetable nucleases, and base editors, while effective for specific applications, remain hindered by transient effects, genotoxicity, and inconsistent exon skipping. To overcome these limitations, here we develop SPLICER, a toolbox of next-generation base editors containing near-PAMless Cas9 nickase variants fused to adenosine or cytosine deaminases for the simultaneous editing of splice acceptor (SA) and splice donor (SD) sequences. Synchronized SA and SD editing improves exon skipping, reduces aberrant splicing, and enables skipping of exons refractory to single splice site editing. To demonstrate the therapeutic potential of SPLICER, we target APP exon 17, which encodes amino acids that are cleaved to form Aβ plaques in Alzheimer’s disease. SPLICER reduces the formation of Aβ42 peptides in vitro and enables efficient exon skipping in a mouse model of Alzheimer’s disease. Overall, SPLICER is a widely applicable and efficient exon skipping toolbox.
外顯子跳過(guò)技術(shù)能夠從成熟的mRNA轉(zhuǎn)錄物中排除靶向外顯子，這在醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)中具有廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)有的技術(shù)，包括反義寡核苷酸、靶向核酸酶和堿基編輯器，雖然對(duì)特定應(yīng)用有效，但仍然受到瞬時(shí)效應(yīng)、遺傳毒性和不一致的外顯子跳過(guò)的阻礙。為了克服這些局限性，我們?cè)谶@里開(kāi)發(fā)了SPLICER，這是一個(gè)下一代堿基編輯器工具箱，包含與腺苷或胞嘧啶脫氨酶融合的近無(wú)PAM-Cas9缺口酶變體，用于同時(shí)編輯剪接受體（SA）和剪接供體（SD）序列。同步SA和SD編輯可以改善外顯子跳過(guò)，減少異常剪接，并能夠跳過(guò)對(duì)單剪接位點(diǎn)編輯不敏感的外顯子。為了證明SPLICER的治療潛力，我們靶向APP外顯子17，該外顯子編碼在阿爾茨海默病中被切割形成Aβ斑塊的氨基酸。SPLICER在體外減少了Aβ42肽的形成，并在阿爾茨海默氏癥的小鼠模型中實(shí)現(xiàn)了有效的外顯子跳躍；疾病?？偟膩?lái)說(shuō)，SPLICER是一個(gè)廣泛適用且高效的外顯子跳過(guò)工具箱。 許多疾病的發(fā)生與異常的基因突變有關(guān)，當(dāng)突變發(fā)生在基因外顯子區(qū)域時(shí)，會(huì)直接導(dǎo)致基因編碼的蛋白序列紊亂，產(chǎn)生的蛋白可能功能失調(diào)或造成細(xì)胞毒性。通常情況下，科學(xué)家會(huì)嘗試清除或中和掉已經(jīng)形成的有害蛋白，來(lái)減輕疾病嚴(yán)重程度；此外，另一項(xiàng)策略則是直接對(duì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的DNA片段進(jìn)行編輯和修改，讓蛋白編碼重回正軌。來(lái)自伊利諾伊大學(xué)厄巴納-香檳分校的Pablo Perez-Pinera教授長(zhǎng)期致力于基因編輯相關(guān)的研究，但與直接改變錯(cuò)誤序列的常規(guī)方式不同，他與同事認(rèn)為跳過(guò)錯(cuò)誤的外顯子區(qū)域或許同樣具備治療潛力。Perez-Pinera教授用做菜作了一個(gè)比喻：當(dāng)菜譜上出現(xiàn)一個(gè)材料錯(cuò)誤時(shí)，直接按配方做可能會(huì)產(chǎn)生奇怪的味道甚至有毒；但如果只是跳過(guò)這種材料，食物最終只是缺乏了某種風(fēng)味但仍可食用。在近期的《自然-通訊》雜志上，Perez-Pinera教授和同事就展示了這樣一種特殊的基因編輯工具SPLICER，它在CRISPR/Cas9的基礎(chǔ)上改造而來(lái)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)特定外顯子的直接跳躍。研究在阿爾茨海默病致病相關(guān)基因——淀粉樣前體蛋白（APP）編碼基因上對(duì)SPLICER的效果進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果顯示SPLICER可以有效減少毒性淀粉樣β蛋白生成，并且沒(méi)有產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。在經(jīng)過(guò)處理的小鼠體內(nèi)，目標(biāo)外顯子水平減少了25%。根據(jù)論文介紹，在CRISPR/Cas9編輯工具中，與目標(biāo)DNA序列相鄰的一小段DNA序列被稱(chēng)作原間隔序列鄰近模塊序列（PAM），它對(duì)于Cas9蛋白識(shí)別靶序列很關(guān)鍵。但同時(shí)，過(guò)度依賴(lài)PAM來(lái)實(shí)現(xiàn)編輯功能，也在一定程度上限制了CRISPR/Cas9在更多外顯子場(chǎng)景中發(fā)揮作用。在新研究中，作者對(duì)各種更新版本的Cas9酶進(jìn)行了測(cè)試和分析，他們挑選了一類(lèi)SpRY Cas9酶。相較于野生型Cas9，這種酶的優(yōu)勢(shì)是對(duì)PAM的依賴(lài)度很低，可以編輯更多數(shù)量的靶標(biāo)。▲SPLICER可以實(shí)現(xiàn)更高效的外顯子跳躍（圖片來(lái)源：參考資料[1]）此外，在外顯子起始兩端分別存在一個(gè)關(guān)鍵序列區(qū)域，能夠保證細(xì)胞自體的基因機(jī)制來(lái)判斷外顯子的位置。過(guò)往的外顯子跳躍工具通常會(huì)靶向其中一個(gè)序列，這樣可能會(huì)遺漏掉一些目標(biāo)外顯子，或者沒(méi)有完整地實(shí)現(xiàn)跳躍。而SPLICER則可以同時(shí)靶向外顯子起始兩端的序列，有效提升了外顯子跳躍效率。作者測(cè)試了SPLICER在數(shù)個(gè)外顯子中的效果，以JAG1外顯子為例，與只靶向外顯子一側(cè)序列相比，SPLICER的外顯子跳躍率提升了28%~37%。隨后，研究進(jìn)一步探索了SPLICER在疾病場(chǎng)景下的應(yīng)用價(jià)值，他們關(guān)注了與阿爾茨海默病發(fā)生密切相關(guān)的APP基因，并選擇性地跳過(guò)了APP的外顯子17。通常情況下，APP蛋白會(huì)被β/γ分泌酶處理生成Aβ42多肽，而這個(gè)切割位點(diǎn)恰好位于APP外顯子17區(qū)域。根據(jù)分析結(jié)果，SPLICER同樣可以比單獨(dú)靶向工具更有效地跳躍APP外顯子17，同時(shí)SPLICER可以將異常剪接事件減少50%以上，避免過(guò)早出現(xiàn)終止密碼子，或部分保留內(nèi)含子的不利影響。此外，SPLICER可以使細(xì)胞中的Aβ42水平下降約70%。在AD模型小鼠中，作者借助腺相關(guān)病毒載體將SPLICER注射到了小鼠的海馬體中，這種方式可以使APP外顯子17減少約25%，有效減少了Aβ42多肽在海馬體中的產(chǎn)生。研究團(tuán)隊(duì)總結(jié)道，外顯子跳躍可以在新產(chǎn)生的蛋白仍然維持功能的情況下使用。對(duì)于阿爾茨海默病、帕金森病，這種方法具有很大的治療潛力，可以幫助避免有害蛋白在大腦中過(guò)度累積。參考資料： [1] Miskalis, A., Shirguppe, S., Winter, J. et al. SPLICER: a highly efficient base editing toolbox that enables in vivo therapeutic exon skipping. Nat Commun 15, 10354 (2024). https:///10.1038/s41467-024-54529-y
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