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結(jié)果： TWAS顯示了DR的顯著轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果在作者的調(diào)查中，作者利用了與DR直接或間接相關(guān)的GWAS數(shù)據(jù)集。采用FUSION方法，沿著共定位和排列測試，作者試圖識別與DR相關(guān)性狀顯著相關(guān)的基因。表現(xiàn)出Z分?jǐn)?shù)高于零的基因被歸類為上調(diào)，而Z分?jǐn)?shù)低于零的基因被認(rèn)為是下調(diào)。這些調(diào)節(jié)模式在圖2中直觀地描述。 此外，作者進(jìn)行了共定位分析，以確定是否與這些基因和DR性狀在特定位點(diǎn)的遺傳信號來自相同的因果多態(tài)性。作者的研究確定了23個(gè)與DR相關(guān)的重要位點(diǎn)，5個(gè)與PDR相關(guān)的特征。所有結(jié)果均通過排列測試（DR中23/23，PDR中5/5）。眾所周知，估計(jì)的關(guān)聯(lián)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)在不存在GWAS關(guān)聯(lián)的情況下得到了很好的校準(zhǔn)，但當(dāng)GWAS基序高度顯著且LD廣泛存在時(shí)，可能會(huì)被偶然的QTL共定位夸大。排列測試重新排列QTL的權(quán)重，并重新計(jì)算經(jīng)驗(yàn)關(guān)聯(lián)統(tǒng)計(jì)的基因座GWAS效應(yīng)的條件。這有效地測試了QTL效應(yīng)大小的相同分布是否可以偶然產(chǎn)生顯著的關(guān)聯(lián)，這將有助于作者確定這些基因與DR相關(guān)性狀之間因果關(guān)聯(lián)的準(zhǔn)確性，而不僅僅是依賴于龐大的GWAS數(shù)據(jù)的相關(guān)性。此外，作者然后對與關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)對應(yīng)的基因進(jìn)行條件分析。接下來，作者使用FOCUS精細(xì)定位來確定前瞻性高置信度的因果基因。DR中9個(gè)特性（包括RPS 26、WFS 1、SRPK 1、BABAM 1、RAB 5 B和SENP 2）和PDR中1個(gè)（DCLRE 1B）通過了精細(xì)映射測試。這表明這些基因與DR高度相關(guān)。通過條件分析和精細(xì)作圖，觀察到顯著基因的上級表現(xiàn)（圖3、4、5、6）。    功能分析顯示，TWAS中的重要基因主要與細(xì)胞器腔、突觸后特化、細(xì)胞-基質(zhì)連接、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)亞區(qū)室和胞內(nèi)囊泡等細(xì)胞成分相關(guān)。它們還與轉(zhuǎn)錄順式調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合、嘌呤核糖核苷酸結(jié)合、絲氨酸水解酶活性、GT3調(diào)節(jié)劑活性、肽酶抑制劑活性、通道活性和來自分子功能的羧酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性相關(guān)（圖7）。在轉(zhuǎn)錄組中分析的49個(gè)組織范圍內(nèi)，作者進(jìn)行了基于大型匯總數(shù)據(jù)的孟德爾隨機(jī)化（SMR）分析，全面涵蓋了大多數(shù)可能性，尋找了92個(gè)關(guān)鍵DR調(diào)節(jié)基因，這些基因在49個(gè)組織中共446次顯著陽性。篩選閾值為SMR P值<1 E ?05沿著FDR P值< 0.05，HEIDI檢驗(yàn)P值> 0.05。這些基因中有60個(gè)是蛋白質(zhì)編碼的。在這些基因中，在關(guān)聯(lián)方面最顯著相關(guān)的是HLA-DQ家族基因，其中HLA-DQB 1、B2、HLA-DQA 2顯示出前三個(gè)顯著性，后兩個(gè)在血液中最顯著，并且最高的是在暴露于陽光的皮膚中最特異和顯著表達(dá)的。從基因重疊的角度來看，作者的基因中出現(xiàn)最頻繁的是HLA-DQ家族。令作者興奮的是，RPS26和WFS1是在多個(gè)DR權(quán)重中揭示的兩個(gè)新的共顯著基因，與TWAS分析的結(jié)果相對應(yīng)。作者發(fā)現(xiàn)RPS26和WFS1的遺傳基因座非常接近，表明對DR的發(fā)展有潛在的聯(lián)合影響（圖8）。此外，SUXO表現(xiàn)出顯著的陽性SMR_P值（圖9），出現(xiàn)在14種不同的組織類型中。這三個(gè)基因構(gòu)成了SMR分析中確定的最關(guān)鍵的元素，突出了它們與研究結(jié)果的關(guān)鍵相關(guān)性。GO富集分析對重要基因的功能進(jìn)行了協(xié)調(diào)的統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，眾多基因共同指向了8條免疫相關(guān)通路，提示DR的進(jìn)展與免疫分子密切相關(guān)，尤其是免疫分子間MHCII類蛋白復(fù)合物的組裝，可能是DR發(fā)生過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在含有55個(gè)基因的49個(gè)組織中共觀察到327個(gè)陽性結(jié)果。篩選條件如前一節(jié)所述。共包括37個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。從顯著性結(jié)果來看，前5位均為HLA-DQ家族：HLA-DQB 1、B2、B6、A1和A2.在出現(xiàn)頻率方面，共有13個(gè)基因出現(xiàn)頻率大于或等于5次，其中，除了排名靠前的HLA-DQB 2在血液中表達(dá)最為突出外，其他HLA-DQ家族基因的結(jié)果，在動(dòng)脈_主動(dòng)脈中也有SKIV 2L表達(dá)的結(jié)果，共出現(xiàn)23次。此外，基因TNXA是感興趣的基因座，總頻率為15次。作者探索了GO數(shù)據(jù)庫上相關(guān)基因的功能注釋，發(fā)現(xiàn)了9個(gè)免疫相關(guān)功能注釋，包括MUC II類蛋白復(fù)合物、髓樣樹突細(xì)胞和抗原-抗體結(jié)合。作者從eQTLgen和Psychencode兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中提取并篩選了順式eQTL數(shù)據(jù)，最終得到了2499和1367個(gè)相應(yīng)的基因。作者對它們分別進(jìn)行了大規(guī)模的藥物靶向MR分析，結(jié)果分別為DR和PDR。使用Bonferroni校正方法確定MR分析的p值閾值，計(jì)算為0.05除以分析的基因總數(shù)，得到eQTLgen的MR p值閾值< 0.00002001（具有2499個(gè)基因），Psychencode（具有1367個(gè)基因）的p值< 0.00003658，Vosa U（具有11個(gè)基因）的p值< 0.00455。FDR還用于觀察P值的校正變化，作為初步篩選指標(biāo)。采用異質(zhì)性Q檢驗(yàn)P值> 0.05和Egger截距檢驗(yàn)P值> 0.05作為敏感性檢驗(yàn)。Steiger濾波器用于檢查eQTLgen中MR結(jié)果的方向性。作者在DR的eQTLgen中獲得了14個(gè)顯著基因，在PDR的eQTLgen中獲得了13個(gè)顯著基因。在初步篩選中，eQTLgen聚生體中DR和PDR之間共有的基因總計(jì)為5個(gè)（ITGB 7、TEK、ITPR 3、C4A、PRKD 2、ERBB 3）（對于IVW，P % 3C 0.00002001）（圖10）。共定位分析后，從eQTLgen中共選出11個(gè)高置信度特征（DR的RPS 26、DR的EIF 2S2P3、DR的KRT 8P46、DR的LRRC 37 A15 P、DR的TP 53 INP1、DR的CDH 2、DR的CTLA 4、DR的ITGB 7、DR的ERBB 3、PDR的KSR 1、PDR的ITGB 7）。eQTLgen中的PDR基因ERBB3也接近陽性，其COLOC.PP.H4為0.949，可能是DR和PDR調(diào)控的樞紐基因。當(dāng)使用Psychencode對DR進(jìn)行雙重測試時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因（SRPK1，ERBB3）在初步篩選中對eQTLgen和Psychencode均呈陽性。在Psychencode測試中，ERBB 3和HLA-B基因在DR和PDR中均顯示陽性結(jié)果。這些結(jié)果提示ERBB 3和SRPK 1可能是DR和PDR易感性的候選效應(yīng)基因。DR相關(guān)基因的綜合多組學(xué)證據(jù)作者綜合分析了三種主要方法的結(jié)果。將所有顯著基因分為四個(gè)等級。作者發(fā)現(xiàn)，在所有三種方法中，全血中的RPS26基因?qū)R的發(fā)展均顯示出顯著的正效應(yīng)（TWAS.Z = 5.92052，SMR.Beta = 0.071，MR.Beta = 0.180）。這些表明RPS 26與DR的發(fā)展之間存在因果關(guān)系。WFS1和SRPK1（第2層）也顯示與DR的發(fā)展存在因果關(guān)系（TWAS. Z. WFS1= 5.4815，SMR β。WFS1= 0.157814，TWAS. Z。SRPK1= 4.88043，MR. SRPK1= 0.124）。在第三層：全血中TP53 INP1、KRT8P46和LRRC37 A15 P在TWAS、SMR和MR中對DR的發(fā)生顯示出正性作用，而全血中EIF 2S2P3在TWAS、SMR和MR中對DR的調(diào)控顯示出負(fù)性作用。SMR和MR結(jié)果顯示負(fù)因果關(guān)系（SMR.Beta =-0.176809，MR.Beta = -0.2664）。在第四層：EHMT 2、C4 A、ERBB 3和SUOX對DR的發(fā)生起負(fù)性作用，SENP 2和RAB 5 B對DR的調(diào)節(jié)起正性作用。為了進(jìn)一步探索作者重要基因的潛在影響，作者使用每個(gè)基因的頂級SNP進(jìn)行了MR-PheWAS分析。p值小于1 E ?05被定義為陽性。結(jié)果顯示，12個(gè)特征中有3個(gè)與最高SNP重復(fù)：rs 223490（LRRC 37 A15 P，KRT 8 P46和RP 11 -10L12.2）。該SNP顯示其潛在作用包括升高β-甘露糖苷酶、降低胱抑素C水平、降低血清肌酐和升高腎小球?yàn)V過率水平。PheWAS顯示EIF 2S 2 P3和WFS 1在DR中的因果作用是誘導(dǎo)2型糖尿病的發(fā)病。DR中的RPS 26和SUOX可誘發(fā)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎并減輕哮喘。這兩個(gè)基因沿著EIF 2S 2 P3和SRPK 1也能降低DR患者的嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)水平。rs 223490（LRRC 37 A15 P、KRT 8 P46和RP 11 -10L12.2）、RPS 26和SUOX使DR患者的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)升高，這些基因的綜合作用提示DR的易感因素。同時(shí)指出DR可能通過不同基因的作用與多種疾病相關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。綜合代謝組學(xué)和免疫組學(xué)對DR進(jìn)展的見解鑒于SMR分析中血液組織和免疫分子的正相關(guān)性的普遍性，作者建議采用免疫組織學(xué)和代謝組學(xué)來進(jìn)一步研究所識別的基因并發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物。代謝組學(xué)和免疫組學(xué)中的陽性結(jié)果定義如下：IVW的P值< 0.05，F(xiàn)DR檢驗(yàn)陽性，Q檢驗(yàn)異質(zhì)性的P值> 0.05，Egger_intercept檢驗(yàn)P值> 0.05，MR-SAMO的p值> 0.05。同時(shí)，作者使用MR Egger進(jìn)行水平多重效度檢驗(yàn)，其P值也應(yīng)大于0.05。在作者的多重敏感性試驗(yàn)篩選后，作者以高置信度篩選了陽性結(jié)果。作者從1，400種代謝產(chǎn)物中獲得了38個(gè)陽性結(jié)果，前5個(gè)已知代謝產(chǎn)物陽性結(jié)果為：1-硬脂酰-GPG（18：0）水平（β = ? 0.255）、1-棕櫚酰-GPE（16：0）水平（β = ? 0.224）、咖啡因水平（β = 0.434）、1-硬脂酰-2-油酰-GPE（18：0/18：1）水平（β = ? 0.149）、己酰谷氨酰胺水平（β = 0.169）。這些鑒定的分子中的大多數(shù)是很少研究的分子，可能會(huì)被添加到未來的研究中（圖11）。對731例DR患者的免疫標(biāo)記物進(jìn)行MR分析，根據(jù)上述MR結(jié)果陽性試驗(yàn)，獲得26例陽性結(jié)果。其中，通過在不同免疫細(xì)胞上主要表達(dá)的分子亞型，證明了幾個(gè)關(guān)鍵的感興趣的亞型：RAFF-R在不同免疫細(xì)胞上的表達(dá)（β < 0），CD 3的突出表達(dá)（β < 0），以及CD 80分子在樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞上的表達(dá)（β > 0）。前五位突出的免疫標(biāo)志物是漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)、活化的CD 4調(diào)節(jié)性T細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)、中央記憶CD 8 + T細(xì)胞%T細(xì)胞、初始CD 8 + T細(xì)胞%CD 8 + T細(xì)胞和CD 4 + T細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)。但令人遺憾的是，在FDR校正后，大多數(shù)分子被證明是微不足道的。通過TWAS或藥物靶向MR鑒定的新基因的小鼠敲除模型作者詢問了小鼠基因組學(xué)（MGI）資源，以獲得基因敲除小鼠中的相關(guān)性狀表達(dá)。在12個(gè)關(guān)鍵基因中，作者發(fā)現(xiàn)WFS1與DR直接相關(guān)。作者發(fā)現(xiàn)與顯著基因表達(dá)高度相關(guān)的注釋信息包括胰島素水平異常、細(xì)胞功能異常和生殖系統(tǒng)功能異常。總結(jié) TWAS通過不同組織間的遺傳關(guān)聯(lián)在DR和PDR中鑒定出多個(gè)穩(wěn)健的遺傳位點(diǎn)（WFS 1、RPS 26和SRPK 1）。同時(shí)，作者在轉(zhuǎn)錄組水平上描述了DR和PDR之間的共同點(diǎn)和差異，以DCLRE 1B為代表，DCLRE 1B是DR進(jìn)展為PDR的樞紐基因。SMR共檢測到92個(gè)DR相關(guān)基因和55個(gè)PDR相關(guān)基因。HLA-DQ家族基因是HLA-DQ家族中出現(xiàn)頻率最高的基因，RPS 26、WFS 1和SRPK 1被認(rèn)為是HLA-DQ家族遺傳網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵基因。藥物靶向MR將ERBB 3和SRPK 1作為DR和PDR易感性的候選效應(yīng)基因。此外，代謝組學(xué)和免疫組學(xué)分析也揭示了DR的多方面致病因素。
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