【原】IC50如何測？拿到數(shù)據(jù)不會處理？常見活性數(shù)值分不清？一文Get！

MCE_China 2024-12-27 發(fā)布于上海

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IC₅₀ 值及其應用場景

IC₅₀(Half maximal inhibitory concentration) 又叫半數(shù)抑制濃度，So，單位是濃度單位，比如 nM、μM 等等。

IC₅₀ 用來指示某一藥物或者物質 (抑制劑) 對某些生物過程 (包含此過程中的某些物質，如酶，細胞、受體或是微生物) 達到 50% 抑制效果時的濃度。IC₅₀ 值越低，表示其抑制效力更強。

我們常在文獻中看到 IC₅₀、EC₅₀、ED₅₀等等數(shù)值的測定，這些指標被廣泛應用于藥物開發(fā)、毒理學、基礎研究等領域，為理解藥物效應和優(yōu)化治療策略提供了有力支持。

IC₅₀ 值的應用：

1. 藥物篩選和開發(fā)

初步篩選：在藥物發(fā)現(xiàn)過程中，IC₅₀ 值用于篩選潛在的藥物候選分子，以確定其對特定靶標如酶抑制的活性。
優(yōu)化化合物：通過比較不同化合物的 IC₅₀ 值，研究人員可以優(yōu)化藥物分子的結構，提高其效能。

2. 評估細胞毒性

細胞生物學研究：IC₅₀ 用于評估化合物對癌細胞或其他細胞類型的毒性，幫助研究其對細胞生長和存活的影響。
毒理學研究：在藥物安全性評估中，IC₅₀ 值用于確定化合物對正常細胞的影響，評估其潛在的副作用。

3. 藥物相互作用研究

聯(lián)合用藥研究：通過測定單獨藥物和聯(lián)合用藥的 IC₅₀，研究不同藥物之間的相互作用和協(xié)同效應，以優(yōu)化治療方案。

常用實驗的 IC₅₀ 值測定

一、激酶抑制劑的 IC₅₀ 值，如何測？

為了尋找新型的 CaMKII 抑制劑作為治療人類心臟疾病的潛在藥物，作者利用高通量系統(tǒng)進行篩選，并在第二次篩選中，對 33 個有潛力的分子化合物進行了 IC₅₀ 值測定，所得 IC₅₀ 最低的前 10 種化合物如下 (圖 1)^[1]。

圖 1. 抑制 CaMKII-δ 激酶 IC₅₀ 值最低的前 10 個分子及其結構曲線^[1]。

? 操作步驟 (供參考^[1])

(1) 激酶自磷酸化：通過將 2 ng/μL CaMKIIδ 重組蛋白與 0.2 mM CaCl₂、10 mM MgCl₂、0.01 mM ATP、200 μM autocamtide-3 (CaMKII-δ 的肽底物)、30 nM CaM 和 0.1 g/mL BSA (來自牛血清的白蛋白) 在含有 25 mM Tris-HCl pH 7.5 的緩沖液中孵育來實現(xiàn)的。

(2) IC₅₀ 值測定：對初篩所得 33 個分子化合物復篩，將其按實驗設計加入激酶反應體系中，進行 IC₅₀ 值測定。

(3) 發(fā)光測定：通過發(fā)光測定監(jiān)測 CaMKII-δ 磷酸轉移酶活性（注意：如果激酶反應不是在室溫下進行，在加入 ADP-Glo? 試劑之前，將板平衡至室溫）。

(4) 記錄發(fā)光：使用微孔板讀數(shù)儀記錄讀數(shù)。

(5) 數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)以平均值 ±SEM 表示。使用 GraphPad Prism 版本 8.01 (GraphPad Software, Inc.) 和 SPSS 24.0 軟件包 (IBM SPSS Statistics，版本 24.0) 進行統(tǒng)計分析。

發(fā)光檢測原理：

當 CaMKII-δ 被激活時，它會通過將 ATP 轉化為 ADP 來磷酸化底物。在該測定中，CaMKII-δ 的肽底物 (Autocamtide-3) 的磷酸化與 ATP 到 ADP 的轉變酶促偶聯(lián)。ADP-Glo 試劑用于終止激酶反應并去除未反應的 ATP。加入激酶檢測試劑終止 ATP 消耗反應并將 ADP 轉化為 ATP，然后通過熒光素酶反應將 ATP 進一步轉化為光。

圖 2. 發(fā)光檢測酶活性原理圖。

二、細胞毒活性試驗的 IC₅₀ 值，如何測？

為了揭示吡啶和噻唑衍生物的抗癌活性，以阿霉素為對照藥，使用 MTT 法測試噻唑基吡啶類化合物對肺癌 (A549) 細胞系的體外抗癌作用，對其進行了 IC₅₀值測定^[2]。

圖 3. 吡啶和噻唑衍生物對肺癌 (A549) 細胞系的抑制作用^[2]。

? 操作步驟 (供參考^[2])

(1) 化合物制備：將合成的化合物及參考藥物阿霉素溶解于 DMSO 中。準備不同濃度的工作溶液以供實驗使用。

(2) 細胞處理：將預培養(yǎng)的細胞系暴露于不同濃度的測試材料，在 37°C 下孵育 24 小時。使用 PBS 清洗去除死細胞。

(3) MTT 染色：向每個孔加入 25 μL 0.5% MTT 染液。在 37°C 條件下孵育 3-4 小時。

(4) 溶解與讀數(shù)：加入 0.05 mL DMSO 溶解細胞內形成的甲瓚晶體，并在搖床上放置 30 min。利用 ELISA 板讀數(shù)儀測量各孔的吸光度值。

(5) 數(shù)據(jù)分析：重復實驗三次，計算平均值。細胞存活率計算公式為：(處理組吸光度/對照組吸光度) × 100%。使用 Master –plex-2010 程序確定 IC₅₀ 值。

IC₅₀值的數(shù)據(jù)計算

IC₅₀ 值的是通過劑量反應曲線 (Dose-Response Curve) 生成，具體方法可能因實驗設計和使用的分析軟件而有所不同，這需要進行一系列不同濃度的藥物處理實驗。

? IC₅₀ 值的數(shù)據(jù)處理

實驗設計：進行細胞或酶實驗，將靶標 (如細胞系、酶等) 暴露于多個不同濃度的藥物中。

記錄數(shù)據(jù)：測量藥物對靶標的抑制效果，例如細胞存活率、酶活性或代謝產物變化。
處理數(shù)據(jù)：將所得表格數(shù)據(jù)進行轉化，使用 Graphpad prism 軟件計算—創(chuàng)建表格—輸入濃度和抑制率—點擊 Analyze，選擇對數(shù)變換--通過非線性回歸 (Non-linear regression) 對實驗數(shù)據(jù)進行擬合---得 IC₅₀ 值，其標準曲線為 S 型曲線。

圖 4. IC₅₀ 值的標準曲線。

需要注意的是！雖然 IC₅₀ 的應用十分廣泛，但 IC₅₀ 值是通過體外實驗獲得的，僅為體外數(shù)據(jù)，不能完全反映藥物在體內復雜環(huán)境下的效果。

ED₅₀、TD₅₀ 和 LD₅₀

活性數(shù)值在藥理學和生物化學領域非常重要，用于描述藥物或分子與靶標之間的相互作用及效果，對于理解藥物作用機制、優(yōu)化化合物結構以及指導臨床用藥等方面都具有重要意義。

下圖是小 M 為大家整理的關于 ED₅₀、TD₅₀ 和 LD₅₀ 的簡要匯總~

小結

本期主要為大家介紹了 IC₅₀，并為大家整理了關于 ED₅₀、TD₅₀和 LD₅₀ 的簡要匯總！下期為大家介紹它的好 “兄弟” EC₅₀~，當然還有其他活性數(shù)值，內容精彩，值得等待！未完待續(xù)……

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參考文獻：

[1] Zhang J, et al. Novel CaMKII-δ Inhibitor Hesperadin Exerts Dual Functions to Ameliorate Cardiac Ischemia/Reperfusion Injury and Inhibit Tumor Growth. Circulation. 2022 Apr 12;145(15):1154-1168.

[2] Ashmawy FO, et al. Synthesis, In Vitro Evaluation and Molecular Docking Studies of Novel Thiophenyl Thiazolyl-Pyridine Hybrids as Potential Anticancer Agents. Molecules. 2023 May 23;28(11):4270.

[3] Gui, H., et al. Effects of Boletus Poisoning on Estrogen Receptors and Neurotransmitters in Rats Based on ERk1/2 Pathway. Neural Process Lett 55, 193–203 (2023).

[4] Abal P, et al. Acute Oral Toxicity of Tetrodotoxin in Mice: Determination of Lethal Dose 50 (LD50) and No Observed Adverse Effect Level (NOAEL). Toxins (Basel). 2017 Feb 24;9(3):75.