|
結(jié)果： ZDHHC1 低表達(dá)與 CRC 預(yù)后不良有關(guān)為了研究ZDHHC家族成員的表達(dá)與CRC的關(guān)系，作者通過TCGA數(shù)據(jù)集和GTEx數(shù)據(jù)集分析了ZDHCCs在CRC患者中的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)分布采用方框圖分析。作者發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，只有ZDHHC14 mRNA在CRC組織中的表達(dá)水平?jīng)]有變化（圖1A）。然后，作者通過 TIMER 2.0 分析了 CRC 患者的 3 年總生存率，并因此篩選出了三個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因（ZDHHC1、ZDHHC3 和 ZDHHC11）（圖1B–D）。這三個(gè)基因都在 CRC 細(xì)胞中過表達(dá)，然后通過免疫印跡（WB）進(jìn)行了驗(yàn)證（圖1E–G）。最后，作者發(fā)現(xiàn) ZDHHC1 的過表達(dá)會(huì)影響 CRC 細(xì)胞的增殖。作者還證實(shí)，HCT116 和 SW480 細(xì)胞在缺脂蛋白培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受阻（圖1H–J）。ZDHHC1 可抑制 CRC 細(xì)胞增殖和侵襲作者使用兩種不同的 shRNAs 沉默了 HCT116 和 SW480 細(xì)胞中 ZDHHC1 的表達(dá)（圖2A），然后通過 MTS 檢測(cè)和集落形成分析評(píng)估了 ZDHHC1 在 CRC 細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。沉默 ZDHHC1 能明顯促進(jìn)癌細(xì)胞增殖（圖2C, E）。此外，透孔試驗(yàn)顯示，ZDHHC1 基因敲除明顯削弱了癌細(xì)胞的侵襲能力（圖2G）。為了確定敲除 ZDHHC1 對(duì)體內(nèi)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，作者將 HCT116 細(xì)胞（表達(dá) shControl 或 shZDHHC1#2）皮下注射到裸鼠體內(nèi)，并評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)情況。作者發(fā)現(xiàn)敲除 ZDHHC1 會(huì)顯著誘導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)（圖2I–K）。相反，異位過表達(dá) ZDHHC1（圖2B）可抑制 HCT116 和 SW480 細(xì)胞中 CRC 細(xì)胞的增殖和侵襲（圖2D, F, H）。這些發(fā)現(xiàn)突顯了 ZDHHC1 在 CRC 進(jìn)展中的關(guān)鍵作用。LIPG 受 ZDHHC1 的負(fù)調(diào)控，通過脂質(zhì)儲(chǔ)存在 CRC 細(xì)胞生長(zhǎng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用作者對(duì)ZDHHC1過表達(dá)的HCT116細(xì)胞進(jìn)行了RNA測(cè)序分析，以探索ZDHHC1抗腫瘤功能的機(jī)制。KEGG 富集分析顯示膽固醇代謝通路非常重要，因此選擇了這一通路作為 ZDHHC1 過表達(dá)的映射通路（圖3A）。作者還發(fā)現(xiàn)，ZDHHC1 與 LIPG 之間存在明顯的負(fù)相關(guān)（圖3B），ZDHHC1 基因敲除會(huì)增加 HCT116 和 SW480 細(xì)胞中 LIPG 蛋白和 mRNA 的表達(dá)（圖3C）。相反，ZDHHC1 過表達(dá)會(huì)降低 CRC 細(xì)胞系中的 LIPG 水平（圖3D）。作者還評(píng)估了 CRC 組織芯片（n= 26 個(gè)樣本）中 ZDHHC1 和 LIPG 蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在反相關(guān)關(guān)系（Pearson correlationr= -0.4017，p= 0.0419；圖3E, F）。接下來，作者評(píng)估了 LIPG 在 CRC 細(xì)胞生長(zhǎng)中的功能。作者使用兩種不同的 shRNAs 沉默了 HCT116 和 SW480 細(xì)胞中 LIPG 的表達(dá)，然后進(jìn)行了 MTS 檢測(cè)和集落形成分析。沉默 LIPG 能明顯抑制癌細(xì)胞的增殖。此外，透孔試驗(yàn)顯示，LIPG 基因敲除明顯削弱了癌細(xì)胞的侵襲能力。相反，異位過表達(dá) LIPG（圖3G）會(huì)增強(qiáng) HCT116 和 SW480 細(xì)胞中 CRC 細(xì)胞的增殖和侵襲能力。因此，作者認(rèn)為L(zhǎng)IPG受ZDHHC1負(fù)調(diào)控，在CRC細(xì)胞生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵作用。先前的研究表明，LIPG 對(duì)高密度脂蛋白（HDL）衍生的磷脂酰膽堿（PC）具有磷脂酶 A1 活性，釋放出的脂質(zhì)產(chǎn)物會(huì)融入細(xì)胞內(nèi) PC 和三酰甘油（TAG）池。因此，作者研究了這種情況是否也適用于 CRC 細(xì)胞。與單獨(dú)轉(zhuǎn)染載體的細(xì)胞相比，LIPG 在高密度脂蛋白存在下的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) TAG 水平的增加以及脂滴（LD）的積累（圖3H, I）。用LIPG抑制劑GSK264220A阻斷LIPG活性[ 21 ]可顯著降低HCT116細(xì)胞內(nèi)的TAG水平和LD積累。在沒有底物的情況下，LIPG 不會(huì)引起這種反應(yīng)，這表明增加細(xì)胞內(nèi) TAG 池需要 LIPG 和底物。ZDHHC1與CRC細(xì)胞中的LIPG相互作用為了評(píng)估LIPG對(duì)于ZDHHCl在CRC中的抗腫瘤作用的重要性，作者使用了表達(dá)shControl、shZDHHCl、shLIPG和shZDHHCl/shLIPG的HCT 116和SW 480細(xì)胞（圖4A, B）。ZDHHCl沉默增加腫瘤生長(zhǎng)，并且單獨(dú)的LIPG沉默抑制CRC細(xì)胞的增殖和侵襲（圖4C–F）。作者還進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以分析ZDHHC 1和LIPG對(duì)致瘤性的影響。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞注射到裸鼠的側(cè)腹以形成異位腫瘤。在21天后，作者觀察到shLIPG組中受損的腫瘤生長(zhǎng)和shZDHHCl組中誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)（圖4G, H）。計(jì)算平均腫瘤重量（圖4I）。ZDHHCl的敲低導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)TAG水平和LD積累的增加，而單獨(dú)的LIPG沉默顯示出相反的結(jié)果（圖4J, K）。值得注意的是，ZDHHC 1和LIPG的組合沉默在體外和體內(nèi)減弱了ZDHHC 1下調(diào)的增殖作用（圖4A–K），表明ZDHHC1通過靶向LIPG進(jìn)行下調(diào)來抑制CRC進(jìn)展。IGF2BP1通過m6A修飾調(diào)節(jié)LIPG mRNA穩(wěn)定性為了闡明ZDHHC 1對(duì)CRC中LIPG的調(diào)節(jié)活性的潛在機(jī)制，作者進(jìn)行了免疫沉淀和質(zhì)譜分析以鑒定ZDHHC 1的結(jié)合配偶體。作者研究了與LIPG基因相關(guān)的前20個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（TF）（ https:// ）和RNA結(jié)合蛋白（RBP）（ https:///encori/ ），并將其與質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行了比較。兩種RBP（IGF2BP 1和TARDBP）被鑒定為ZDHHCl的潛在結(jié)合配偶體（圖 5A ）。免疫共沉淀結(jié)果證實(shí)了HCT 116和SW 480細(xì)胞中ZDHHC 1和IGF2BP 1之間的相互作用（圖5B,C）。由于IGF2BP1被認(rèn)為是RBP，也稱為m6A RNA修飾中的“閱讀器”，作者研究了IGF2BP1是否通過m6A修飾與LIPG相互作用。首先，作者發(fā)現(xiàn)IGF2BP1敲低降低了LIPG的蛋白質(zhì)和mRNA水平（圖5D）。接下來，作者在HCT 116和SW 480細(xì)胞中使用抗IGF 2BP 1抗體進(jìn)行RIP-qPCR測(cè)定，結(jié)果顯示與IgG對(duì)照組相比，LIPG mRNA顯著富集（圖5E）。為了驗(yàn)證LIPG是否受m6 A修飾的影響，作者進(jìn)行了MeRIP-qPCR測(cè)定，發(fā)現(xiàn)與相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞相比，IGF 2BP 1的敲低顯著降低了CRC細(xì)胞中的LIPG m6 A水平（圖5F）?；赟RAMP軟件分析，作者在LIPG mRNA的編碼序列（CDS）和內(nèi)含子區(qū)中鑒定了兩個(gè)高置信度的m6 A位點(diǎn)（圖5G）。為了驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，作者使用含有野生型（WT）LIPG或突變型（MT）LIPG序列的熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定（圖5H）。如所預(yù)期的，當(dāng)IGF 2BP 1沉默時(shí)，在LIPG WT測(cè)定中熒光素酶活性顯著減弱，而LIPG-MT似乎不受影響（圖5I）。此外，mRNA穩(wěn)定性測(cè)定顯示，在HCT 116和SW 480細(xì)胞中，IGF2BP1沉默降低了LIPG的mRNA表達(dá)，并且持續(xù)縮短了LIPG的mRNA半衰期（圖5J,K）。總體而言，這些發(fā)現(xiàn)表明IGF2BP1以m6A修飾依賴性方式直接結(jié)合并穩(wěn)定LIPG mRNA。 ZDHHC 1是誘導(dǎo)IGF 2BP 1-C337 S-棕櫚?；腎GF 2BP 1-棕櫚?；?/span>作者的數(shù)據(jù)顯示，ZDHHC 1不調(diào)節(jié)IGF 2BP 1的蛋白和mRNA水平（圖 6A, B ）。先前的數(shù)據(jù)表明ZDHHCl是調(diào)節(jié)各種蛋白質(zhì)棕櫚?；淖貦磅ｕ；D(zhuǎn)移酶[ 24 ];因此，作者推測(cè)IFG 2BP 1半胱氨酸可能被ZDHHCl棕櫚?；Ｒ虼?，使用表達(dá)HCT 116的FLAG-ZDHHCl的細(xì)胞通過?；?生物素交換（ABE）技術(shù)評(píng)估蛋白質(zhì)棕櫚酰化狀態(tài)，其揭示了IGF 2BP 1在CRC細(xì)胞中被棕櫚?；▓D6C）。在棕櫚?；种苿?-溴棕櫚酸酯（2-BP）的存在下，棕櫚酰化IGF 2BP 1的增加幾乎完全被抵消（圖6D）。為了鑒定IGF 2BP 1中已被ZDHHCl棕櫚?；陌腚装彼釟埢髡呃米貦磅；稽c(diǎn)預(yù)測(cè)工具（ https://www./ ）。在IGF 2BP 1內(nèi)的潛在半胱氨酸殘基中，C257、C336和C337具有最高評(píng)分（圖6E）?；诖?，作者構(gòu)建了各種IGF 2BP 1突變體;然而，只有C337 S突變消除了IGF 2BP 1的棕櫚?；▓D6F）。此外，發(fā)現(xiàn)C337棕櫚?；稽c(diǎn)在不同動(dòng)物物種中高度保守（圖6G）。作者還發(fā)現(xiàn)Flga-ZDHHCl降低IGF 2BP 1野生型（WT）中的LIPG水平，但不降低IGF 2BP 1-C337 S中的LIPG水平（圖6H–J）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，ZDHHCl可能是IGF 2BP 1-棕櫚酰化酶，其誘導(dǎo)IGF 2BP 1-C337處的S-棕櫚?；韵抡{(diào)LIPG的表達(dá)。ZDHHC 1/IGF 2BP 1/LIPG信號(hào)軸抑制CRC細(xì)胞生長(zhǎng)接下來，作者沉默了HCT 116細(xì)胞中的ZHDDC 1、IGF 2BP 1和ZHDDC 1/IGF 2BP 1表達(dá)。ZDHHC 1敲低上調(diào)LIPG表達(dá)水平;然而，ZDHHC 1和IGF 2BP 1的雙重敲低消除了ZDHHC 1調(diào)節(jié)LIPG表達(dá)的能力（圖 7A ）。此外，ZDHHC 1過表達(dá)在蛋白質(zhì)和mRNA水平上均降低HCT 116細(xì)胞中的LIPG表達(dá)（圖7B）。作者還發(fā)現(xiàn)IGF 2BP 1敲低增加了ZDHHCl介導(dǎo)的LIPG下調(diào)（圖 7B ）?？傊@些數(shù)據(jù)表明ZDHHCl通過IGF 2BP 1的棕櫚?；抡{(diào)LIPG表達(dá)并抑制CRC生長(zhǎng)（圖 7C ）。總結(jié) 作者的研究首次揭示了ZDHHC 1在CRC細(xì)胞中的臨床和生物學(xué)功能。作者證明ZDHHC 1通過IGF 2BP 1的棕櫚?；詍6 A依賴的方式降低LIPG mRNA的穩(wěn)定性來抑制CRC生長(zhǎng)，這表明ZDHHC 1/IGF 2BP 1/ LIPG信號(hào)傳導(dǎo)軸可能是CRC進(jìn)展的重要介質(zhì)，并且抑制LIPG可能是延長(zhǎng)CRC患者生存的潛在策略。
|
