在蛋白降解技術(shù)中，基于溶酶體系統(tǒng)開發(fā)的靶向蛋白降解技術(shù)有哪些？AUTOTAC、第一代、第二代 AUTAC? 你能分清嗎？


01
蛋白降解技術(shù)

在蛋白降解技術(shù)中，目前最具開發(fā)潛力的是利用泛素化-蛋白酶體途徑的靶向降解技術(shù)，其代表技術(shù)為 PROTAC。但蛋白酶體系統(tǒng)并不適用于所有蛋白的降解，如與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的蛋白聚集體、較大體積的蛋白或非蛋白靶標(biāo)，如脂滴等。
除蛋白酶體降解系統(tǒng)之外，溶酶體降解系統(tǒng)也是真核細(xì)胞中重要的降解途徑。由于溶酶體含有多種酸性水解酶，可降解包括蛋白、核酸、脂質(zhì)在內(nèi)的多種物質(zhì)，很好地補充了蛋白酶體降解系統(tǒng)的不足。

圖 1. 基于自噬溶酶體系統(tǒng)開發(fā)的自噬依賴靶向降解技術(shù)^[1]。

(1) 以 PROTACs 和 AUTAC 為例，誘導(dǎo)感興趣目標(biāo) (TOIs) 和標(biāo)記機制之間的接近，向 TOI 添加易于自噬的標(biāo)簽，然后可以識別這些標(biāo)簽;(2)如 TPA 和AUTOTACs，直接向 TOIs 招募識別機器；(3) 利用上游自噬機制或調(diào)節(jié)因子作為 MOIs，在 TOIs 位點觸發(fā)自噬體的生物發(fā)生；(4) 以 ATTECs 為代表的策略四將  TOIs 和 mATG8s 結(jié)合在一起，將 TOIs 連接到一個吞噬體上。

目前基于溶酶體系統(tǒng)開發(fā)的靶向蛋白降解技術(shù)包括AUTAC (AUtophagy-TArgeting Chimera)，AUTOTAC (AUTOphagy-TArgeting Chimera)，ATTEC (Autophagosome-tethering compound) (詳見：ATTEC 分子: 通過自噬降解多靶點的閃亮新星！（詳情：mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzI5MjMyNDQ0Mw==&mid=2247601351&idx=1&sn=3c221d4a4bd4b942799cfda25d2d2fe1&chksm=ec0019f3db7790e51d2fa4002a8bab77199cccc899d4d6d99f83bf1b48af1d14b32c0fc62c4a&scene=21#wechat_redirect）)等。其中 AUTAC 、AUTOTAC 及 ATTEC 是利用自噬-溶酶體降解機制進行蛋白降解。

第一代/ 第二代 AUTAC & 第二代AUTOTAC 

第一代 AUTAC 和第二代 AUTAC 既然都叫 AUTAC，所以降解機制是一樣的。

而 AUTAC 和 AUTOTAC 名字雖然很像，但二者從作用機制上還是存在差異的。AUTAC 是誘導(dǎo)底物打上泛素化標(biāo)簽，底物受體通過泛素化標(biāo)簽與底物結(jié)合，而 AUTOTAC 是直接將底物與底物受體結(jié)合起來。

由于基于自噬溶酶體系統(tǒng)的蛋白降解技術(shù)的開發(fā)基礎(chǔ)是選擇性自噬機制，所以首先我們先了解一下選擇性自噬的機制。

02
選擇性自噬機制

選擇性自噬機制主要包括兩個過程：底物識別和分離膜招募^[1]。其機制如下：

• 底物識別: 底物受體與底物結(jié)合，主要有兩種方式：(1) 通過降解標(biāo)簽結(jié)合：識別機器 (底物受體，支架蛋白等) 結(jié)合底物表面的降解標(biāo)簽。(2) 直接結(jié)合：識別機器直接與底物結(jié)合。

• 分離膜招募: 大部分底物受體都通過結(jié)合分離膜表面的 mATG8 蛋白而招募分離膜。除上述機制外，一些底物受體以及支架蛋白還可招募上游自噬機器 (autophagy machinery) 及它們的調(diào)節(jié)蛋白，例如 ULK1 復(fù)合物與 BK1 等，以促進在底物所在位置 (in situ，即原位) 形成分離膜。

圖 2. 選擇性自噬作用機制^[1]。

在底物一端，一些識別機器結(jié)合特定的降解標(biāo)簽 (tag)，例如泛素、N-degron 或特定的糖鏈，這些標(biāo)簽可以被修飾在底物表面，也可以由底物內(nèi)部暴露出來；另一些底物受體可直接結(jié)合底物。在另一端，大部分底物受體都通過結(jié)合分離膜表面的 mATG8 蛋白而招募分離膜；除此之外，一些底物受體以及支架蛋白還可招募上游自噬機器 (autophagy machinery) 及它們的調(diào)節(jié)蛋白，例如 ULK1 復(fù)合物與 TBK1 等，以促進在底物所在位置 (in situ，即原位) 形成分離膜。

03
AUTOTAC

AUTOTAC (AUTOphagy-TArgeting Chimera), 即自噬靶向嵌合體。AUTOTAC 包括三部分：目的蛋白配體、p62 靶向配體以及連接二者的 linker。

  AUTOTAC 作用機制：
AUTOTAC 和 p62 的 ZZ 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使得原本無活性的 p62 構(gòu)象被激活誘導(dǎo)為自噬相容形式，暴露出 PB1 和 LIR 結(jié)構(gòu)域，PB1 和 LIR 分別可以促進 p62 與靶蛋白復(fù)合物的自聚集及其與自噬膜上 LC3 的相互作用，從而誘導(dǎo)靶蛋白經(jīng)過溶酶體降解^[2]。其中p62就是一種底物受體，AUTOTAC通過將底物與受體連接，實現(xiàn)底物識別，進而被降解，所以AUTOTAC 的機制是介導(dǎo)底物受體與底物的結(jié)合，即底物識別中的直接結(jié)合機制。

圖 3. AUTOTAC 可能作用機制^[2]。 

研究表明，利用 AUTOTAC 技術(shù)可成功在體外和體內(nèi)降解神經(jīng)退行性病變中的癌蛋白和蛋白質(zhì)聚集體。該技術(shù)的可行性為蛋白降解領(lǐng)域提供了一個新的策略。

研究人員首先針對 p62 的 ZZ 結(jié)構(gòu)域進行 3D 建模，然后進行結(jié)構(gòu)和活性研究，最終確定了 YOK-2204、YOK-1304 和 YTK-105 三種化合物，之后通過 PEG linker 將 p62-ZZ 配體和靶蛋白配體連接合成多種 AUTOTAC，并驗證了 AUTOTAC 不僅可以介導(dǎo)癌蛋白降解，還可以降解錯誤折疊蛋白即蛋白聚集體的降解^[2]。

與 PROTAC 相比，PROTAC 實現(xiàn)靶蛋白的有效降解和 Linker 長度及類型密切相關(guān)，但 AUTOTAC 的效果或許并不特別的依賴于 Linker 的長度，這為 AUTOTAC 設(shè)計提供了更多的靈活性^[2]。

圖 4. 自噬靶向配體作用模式的模型 (a) 與自噬靶向配體的化學(xué)結(jié)構(gòu) (b) ^[2]。

04
AUTAC

AUTAC (AUtophagy-TArgeting Chimera) 主要由 3 部分組成，分別是靶蛋白配體、Linker 和降解標(biāo)簽鳥嘌呤衍生物 (GD)。

AUTAC 的作用原理：通過降解標(biāo)簽?zāi)M S-鳥苷酸化修飾，誘導(dǎo)靶蛋白的多聚泛素化，即給靶蛋白打上降解標(biāo)簽，識別機器通過降解標(biāo)簽與靶蛋白結(jié)合，實現(xiàn)底物識別。所以 AUTAC 機制不同于 AUTOTAC，是借助降解標(biāo)簽實現(xiàn)底物識別。

AUTAC 具有更加廣泛的降解范圍，不僅可以降解細(xì)胞質(zhì)蛋白，還可以實現(xiàn)降解個頭較大的細(xì)胞器，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和過氧化物酶體等。

第一代 AUTAC

研究發(fā)現(xiàn)，在鏈球菌自噬清除過程中，S-鳥苷化在多泛素化過程中具有重要機制，然而具體的自噬機制仍然不清楚?；谥把芯勘尘?，第一代 AUTACs 選擇鳥嘌呤衍生物 (cGMP) 作為自噬標(biāo)簽來誘導(dǎo)內(nèi)源性 S-鳥苷酸化。所有報道的第一代 AUTAC 化合物均具有半胱氨酸作為亞結(jié)構(gòu)^[3]。

圖 5. AUTAC 作用機制 (左) 部分報道的第一代 AUTAC 分子(右) ^[3]。

第二代 AUTAC

第一代 AUTAC 的開發(fā)，主要集中在替代內(nèi)源性 S-鳥苷化中發(fā)現(xiàn)的磷酸化核糖結(jié)構(gòu)，因為 cGMP 的半胱氨酸亞結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致不必要的蛋白激酶 G (PKG) 激活。此外，環(huán)磷酸的負(fù)電荷可能會影響 AUTAC 細(xì)胞膜的通透性。

Hirokazu Arimoto 教授團隊基于此前研究背景對 AUTACs 進行了結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系 (SAR) 研究，分別對第一代 AUTAC 鳥嘌呤部位及半胱氨酸部位用不同結(jié)構(gòu)進行替換，發(fā)現(xiàn)鳥嘌呤在 AUTAC 中發(fā)揮重要作用，而用吡唑環(huán)替代半胱氨酸可以明顯提高 AUTAC 活性。第二代 AUTAC 與第一代 AUTAC 相比，其活性提高了 100 倍^[4]。

圖 6. 靶向自噬降解的第二代 AUTAC^[4]。

05
小結(jié)

AUTAC 與 AUTOTAC 都是利用自噬-溶酶體降解機制進行蛋白降解，都是在底物識別階段介導(dǎo)蛋白降解，但具體的降解機制略有不同，AUTAC 是誘導(dǎo)底物打上泛素化標(biāo)簽，底物受體通過泛素化標(biāo)簽與底物結(jié)合，而 AUTOTAC 是直接將底物與底物受體結(jié)合起來。

 參考文獻：
[1] Yiqing Zhang, et al. Manipulating autophagic degradation in human diseases: from mechanisms to interventions. 5 July 2022; Accepted: 8 October 2022.  Life Medicine, 2022, Volume 1.

[2] Ji CH, et al. The AUTOTAC chemical biology platform for targeted protein degradation via the autophagy-lysosome system. Nat Commun. 2022 Feb 16;13(1):904. 
[3] Takahashi D, et al. AUTACs: Cargo-Specific Degraders Using Selective Autophagy. Mol Cell. 2019 Dec 5;76(5):797-810.e10. 
[4] Takahashi D, et al. Second-Generation AUTACs for Targeted Autophagic Degradation. J Med Chem. 2023 Sep 14;66(17):12342-12372.