來源：分子莊園

一、酶標(biāo)抗體技術(shù)

酶標(biāo)抗體技術(shù)是通過共價鍵將酶連結(jié)在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，于光鏡或電鏡下進(jìn)行細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)各種抗原成分的定位。

1、用于標(biāo)記的酶的特點(diǎn)

①酶催化的底物必須是特異的，且容易被顯示，所形成的產(chǎn)物易于光鏡或電鏡下觀察；

②所形成的終產(chǎn)物沉淀必須穩(wěn)定，即終產(chǎn)物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，影響組織學(xué)定位；

③為較易獲得的酶分子，最好可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)出售；

④中性pH時，酶應(yīng)穩(wěn)定，酶標(biāo)記抗體后，保存1-2年活性不應(yīng)改變，且酶的催化活性越高越好；

⑤被檢測組織中，不應(yīng)存在與標(biāo)記酶相同的內(nèi)源性酶或類似物質(zhì)。

2、辣根過氧化物酶（HRP）

HRP廣泛分布于植物界，以植物辣根(西洋山崳菜)的葉內(nèi)含量最豐富而得名。

HRP是由無色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉結(jié)合組成的一種糖蛋白，糖占16%-18(8條糖鏈分布在HRP分子表面)，分子量40kD，最適pH5-5.5，最適溫度40-45℃；pH4-11，50℃以下均較穩(wěn)定，易溶于水和58%以下的飽和硫酸銨溶液。

酶的活性中心含鐵卟啉，稱輔基，最大吸收光譜為403nm，而其余非活性的酶蛋白部分吸收光譜為275nm，HRP的純度是用二者的光密度比值(OD403/275)衡量，用RZ表示。一般認(rèn)為，標(biāo)記酶的RZ值為3.0左右，不應(yīng)小于2.8，RZ值越小，酶的純度越差，對于純度低、質(zhì)量差的酶，需純化后使用。

HRP特異底物為H?O?，在分解H?O?過程中，與H?O?形成復(fù)合物，無電子供體存在時，反應(yīng)不再進(jìn)行，當(dāng)電子供體存在時，迅速生成水，酶被還原，電子供體被氧化環(huán)化，形成苯乙胼聚合體。在酶反應(yīng)部位，形成不溶性棕褐色沉淀，與組織對比清晰。

HRP催化的酶促反應(yīng)第一步是特異性的—酶催化底物H?O?，其余反應(yīng)是非特異的，可用各種電子供體介導(dǎo)，所以選用不同的電子供體，可使終產(chǎn)物呈不同顏色，例如，CN為藍(lán)黑色，TMB為深藍(lán)色，AEC為紅色。

DAB是廣泛應(yīng)用的電子供體之一，較敏感，切片可脫水透明、半永久保存，且終產(chǎn)物具有嗜餓性，經(jīng)O2O4處理，電子密度增加，適于電鏡下確定抗原的存在部位。

3、堿性磷酸酶（ ALP）

4、葡萄糖氧化酶（GOD）

GOD所催化的底物為葡萄糖，電子供體為對硝基四唑藍(lán)(P-Nitroblue Tetrazolium)，終產(chǎn)物為不溶性的藍(lán)色沉淀，比較穩(wěn)定。

從理論上講GOD較ALP、HRP為佳，因?yàn)椴溉閯游锝M織內(nèi)不存在內(nèi)源性GOD，但其分子量較大，具有較多的氨基，在標(biāo)記時易形成廣泛的聚合，影響酶的活性，故GOD主要用于ICC雙重染色和兩種酶的放大技術(shù)。

二、酶標(biāo)抗體的制備

酶標(biāo)抗體與熒光色素標(biāo)記抗體不同，它需借助橋-偶聯(lián)劑的作用，將酶連結(jié)在抗體分子上。

1、偶聯(lián)劑

偶聯(lián)劑是一種雙功能試劑，具備3個基本特征：①偶聯(lián)劑與抗體和酶之間的連結(jié)，必須是不可逆的，即借共價鍵連結(jié)；②偶聯(lián)劑不應(yīng)影響酶和抗體的活性；③不能因偶聯(lián)劑的加入，使酶與組織成分了生非特異結(jié)合。

在HRP標(biāo)記抗體中，常用的偶聯(lián)劑有戊二醛、過碘酸鈉及Maleimide等。

1）戊二醛

其制備方法分一步法和兩步法；基本原理相同，是使戊二醛的兩個醛基之一與酶蛋白的賴氨酸結(jié)合，另一醛基與免疫球蛋白上的氨基結(jié)合，將酶連結(jié)于抗體上。

①一步法：將酶、抗體、戊二醛按一定比例混合，經(jīng)透析除去標(biāo)記物中剩余的戊二醛，制得酶標(biāo)抗體。

優(yōu)點(diǎn)是簡單省時，缺點(diǎn)是反應(yīng)程度不易被控制，因?yàn)槊傅鞍追肿雍涂贵w蛋白分子同戊二醛間的反應(yīng)速率不同，抗體蛋白的氨基數(shù)遠(yuǎn)較HRP為多，與戊二醛反應(yīng)快，因此在戊二醛的作用下，抗體蛋白易通過分子內(nèi)和分子間的彼此交聯(lián)，形成較大的聚合體，而與酶蛋白分子間的交聯(lián)相應(yīng)減少，影響酶的標(biāo)記。

據(jù)Nakane等推算，加入的HRP僅20%與抗體連結(jié)，標(biāo)記率較低(約1%-5%)很難獲得理想的酶標(biāo)抗體。

②二步法：首先用過量的戊二醛與HRP反應(yīng)(HRP：戊二醛為1:105)，以保證酶分子僅與戊二醛的一個醛基結(jié)合，另一個醛基游離；然后用層析法除去多余的戊二醛，制成活性HRP(HRP-戊二醛復(fù)合物)，再加入過量的抗體，使活化HRP上剩余的醛基與抗體蛋白分子上的氨基結(jié)合，制成酶標(biāo)抗體。

過量的抗體可以保證酶與抗體間均勻連結(jié)，避免酶本身聚合。根據(jù)所用的HRP與抗體(IgG)比例不同，酶標(biāo)記率各異，平均為5%-25%。

標(biāo)記步驟：

2）過碘酸鹽氧化法

過碘酸鈉并非作為橋連結(jié)在抗體和酶之間，而是借助于過碘酸鈉的氧化作用，將酶連結(jié)在抗體上。該方法僅適于含糖較豐富的酶(如HRP)的標(biāo)記。

HRP分子的糖本身與酶活性無關(guān)，利用過碘酸鈉氧化這部分糖分子內(nèi)的-CH基，使之生成-CHO基，再與抗體蛋白的游離氨基反應(yīng)，生成Shiff′s堿。此Shiff′堿在pH降低時呈可逆性解離，所以經(jīng)氫硼化鈉(NaBH?)還原，形成穩(wěn)定的酶標(biāo)抗體復(fù)合物。

為防止生成的-CHO基與酶蛋白氨基自身交聯(lián)，預(yù)先可用二硝基氟苯(Dintro-fluorobenzene)處理HRP，阻斷分子內(nèi)的ε-、α-氨基。

標(biāo)記步驟：

參考文獻(xiàn)：

［1］這些免疫組化染色方法你知道嗎？快來get?。?！-萬孚學(xué)社

［2］中醫(yī)寶典 > 中醫(yī)雜集 > 《實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸》