中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所羅小舟研究員和Jay. D. Keasling教授課題組在 Nature Synthesis 期刊發(fā)表了題為：Engineering yeast for de novo synthesis of jasmonates 的研究論文。

該研究針對(duì)現(xiàn)階段植物激素茉莉素在生產(chǎn)上面臨的化學(xué)合成難度大、植物提取得率低等挑戰(zhàn)，提出在釀酒酵母中重構(gòu)茉莉素的生物合成途徑，建立微生物細(xì)胞工廠以實(shí)現(xiàn)高效和綠色生產(chǎn)，為茉莉素在農(nóng)業(yè)及化妝品行業(yè)的規(guī)?；瘧?yīng)用鋪平道路。

合成生物學(xué)的發(fā)展使得天然產(chǎn)物的異源生產(chǎn)成為可能。自1962年從素馨花中首次發(fā)現(xiàn)并分離茉莉酸甲酯以來(lái)，科學(xué)家一直致力于茉莉素生物合成通路的解析，完整的合成途徑在2012年問(wèn)世。

茉莉素在植物中的合成過(guò)程較為復(fù)雜，通路長(zhǎng)，酶促類型多樣，還涉及中間產(chǎn)物在不同細(xì)胞器間的轉(zhuǎn)運(yùn)：磷脂酶先將α-亞麻酸（α-LeA）從葉綠體膜上釋放；α-LeA在葉綠體內(nèi)，由多酶復(fù)合體催化形成12-氧代-植物二烯酸（OPDA）；OPDA在過(guò)氧化物酶體中，經(jīng)過(guò)3輪β-氧化生成茉莉酸（JA）；JA在細(xì)胞質(zhì)中被轉(zhuǎn)化為下游衍生物茉莉酸甲酯（MeJA）、茉莉酸異亮氨酸（JA-Ile）等。

公認(rèn)安全的釀酒酵母因含有多種細(xì)胞器，被該團(tuán)隊(duì)優(yōu)先選擇為茉莉素異源從頭合成的微生物底盤。合成途徑的復(fù)雜度為重構(gòu)工作帶來(lái)不少挑戰(zhàn)，其中，在酵母中找尋適合中間體α-LeA和OPDA合成的場(chǎng)所，是途徑重構(gòu)首要解決的難題。

圖1：茉莉素的生物合成通路。根據(jù)產(chǎn)物類型和合成場(chǎng)所的不同，將茉莉素在酵母中的重構(gòu)途徑分為4個(gè)模塊：模塊1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成α-LeA；模塊2在細(xì)胞質(zhì)中合成OPDA；模塊3在過(guò)氧化物酶體中合成JA；模塊4在細(xì)胞質(zhì)中合成MeJA和JA-Ile?；疑硐鄳?yīng)化合物在植物中的合成場(chǎng)所。

在該研究中，研究團(tuán)隊(duì)首先在酵母的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成α-LeA。α-LeA在植物的葉綠體中被合成，而酵母缺少葉綠體結(jié)構(gòu)；酵母雖不能從頭合成α-LeA，卻可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成α-LeA的前體。受啟發(fā)于此，該團(tuán)隊(duì)嘗試在酵母的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成α-LeA。通過(guò)在釀酒酵母中引入克魯維酵母來(lái)源的FAD，實(shí)現(xiàn)α-LeA在酵母的從頭合成（圖2A），但α-LeA的產(chǎn)量?jī)H0.7 mg/L，遠(yuǎn)不夠進(jìn)行下游轉(zhuǎn)化。共聚焦實(shí)驗(yàn)表明，相關(guān)基因均成功定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（圖2B）。同時(shí)，研究人員還基于改造自由脂肪酸的代謝通路（圖2C），將α-LeA的產(chǎn)量提升至51.2 mg/L（圖2D）。

圖2：在酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成α-LeA

其次，在酵母的細(xì)胞質(zhì)中合成OPDA。OPDA在植物的葉綠體中被合成，同樣需要在酵母中尋找適合OPDA合成的場(chǎng)所。細(xì)胞質(zhì)和過(guò)氧化物酶體是潛在的候選選項(xiàng)：若在細(xì)胞質(zhì)中合成OPDA，后續(xù)需要OPDA轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)過(guò)氧化物酶體完成下游轉(zhuǎn)化；若在過(guò)氧化物酶體中合成OPDA，則需要底物α-LeA先行轉(zhuǎn)運(yùn)至過(guò)氧化物酶體。考慮到α-LeA在過(guò)氧化物酶體中被降解的可能性，該團(tuán)隊(duì)嘗試將OPDA合成途徑（LOX、AOS和AOC）定位至酵母的細(xì)胞質(zhì)中。首先對(duì)不同來(lái)源的LOX進(jìn)行活性篩選（圖3A）和組合表達(dá)，將中間體13-HPOT的產(chǎn)量提升至10.8 mg/L（圖3B）。繼續(xù)引入AOS和AOC，成功實(shí)現(xiàn)OPDA的生產(chǎn)，產(chǎn)量4.9 mg/L（圖3C和3D）。共聚焦實(shí)驗(yàn)表明，相關(guān)基因均成功定位在酵母的細(xì)胞質(zhì)（圖3E）。

圖3：在酵母細(xì)胞質(zhì)中合成OPDA

緊接著，在酵母的過(guò)氧化物酶體中合成JA。鑒于植物和酵母在β-氧化過(guò)程上的相似性，該研究直接模仿植物中JA的合成過(guò)程，在酵母中引入保留了自身過(guò)氧化物酶體定位肽的相關(guān)酶（OPR、ACS、ACX、MFP和KAT），在過(guò)氧化物酶體中成功實(shí)現(xiàn)JA的合成，產(chǎn)量達(dá)9.6 mg/L（圖4A和4B），進(jìn)一步飼喂底物α-LeA，JA的產(chǎn)量可達(dá)19.0 mg/L。

圖4：在酵母過(guò)氧化物酶體中合成JA

最后，在酵母的細(xì)胞質(zhì)中合成MeJA和JA-Ile等衍生物。在產(chǎn)JA的酵母底盤中引入JMT以合成MeJA，產(chǎn)量3.1 mg/L（圖5A和5B）；引入JAR合成JA-Ile，產(chǎn)量7.0 mg/L（圖5C和5D）。

圖5：在酵母細(xì)胞質(zhì)中合成MeJA和JA-Ile

至此，研究團(tuán)隊(duì)成功建立了植物激素茉莉素的酵母細(xì)胞工廠。相較于傳統(tǒng)的植物提取，此法在生產(chǎn)上不受時(shí)令限制、可規(guī)模化放大，為茉莉素的高效和綠色生產(chǎn)提供了重要的參考。

中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)院合成生物學(xué)研究所羅小舟研究員、Jay. D. Keasling教授和湯紅婷副研究員為論文共同通訊作者，團(tuán)隊(duì)成員湯紅婷副研究員、林淑敏和鄧吉良為論文并列第一作者。該研究獲得國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金委、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金委、深圳市科技計(jì)劃及深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院等多個(gè)項(xiàng)目的支持。同時(shí)，感謝于濤研究員在脂肪酸代謝通路改造研究上的學(xué)術(shù)討論和寶貴意見；感謝科研助理魏珍琴在項(xiàng)目實(shí)施過(guò)程中協(xié)助組織會(huì)議討論；感謝化學(xué)與組學(xué)分析平臺(tái)為本項(xiàng)目的色譜和質(zhì)譜分析提供強(qiáng)大的硬件支撐。