分子診斷使用通用或特異性的核酸檢測(cè)方法。 核酸可以通過吸光度和熒光光學(xué)技術(shù)進(jìn)行定量。 具體的檢測(cè)和定量方法通常使用具有熒光或電子檢測(cè)的序列特異性引物或探針。 各種印跡技術(shù)（例如 Southern bot 轉(zhuǎn)移和點(diǎn)印跡）使用不同方式標(biāo)記的探針來識(shí)別目標(biāo)序列。 同樣，在擴(kuò)增技術(shù)中使用各種探針來識(shí)別感興趣的靶標(biāo)。

檢測(cè)技術(shù)

核酸探針

紫外線吸光度和熒光染料本身并不區(qū)分不同的核酸序列（即，它們不是序列特異性的）。 核酸檢測(cè)的特異性幾乎總是來自于由靶序列和互補(bǔ)探針或引物組成的兩條互補(bǔ)核酸鏈的雜交。 許多報(bào)告分子可以共價(jià)連接或摻入核酸探針中。 這些探針的使用可以揭示與探針的核酸部分互補(bǔ)的序列的物理存在或位置。 第一個(gè)用于核酸檢測(cè)的探針是放射性標(biāo)記的。 放射性標(biāo)記的探針由于同位素衰變和核酸的放射分解而具有較短的保質(zhì)期。 這種固有的不穩(wěn)定性，加上對(duì)放射性同位素安全和處置的擔(dān)憂，限制了放射性探針在臨床實(shí)驗(yàn)室的使用。

雜交探針的間接檢測(cè)

非放射性探針的第一個(gè)實(shí)際例子使用了生物素標(biāo)記的 dUTP 類似物。盡管空間構(gòu)型發(fā)生了改變，大多數(shù) DNA 聚合酶仍會(huì)摻入該核苷酸。 其他官能團(tuán)，例如地高辛，也可以通過與 dUTP 化學(xué)連接并摻入多核苷酸中用作親和標(biāo)記。 或者，可以在合成過程中用生物素或氨基接頭標(biāo)記寡核苷酸探針，以便隨后連接到指示分子。 分子 5’ 或 3’端的標(biāo)記通常是首選，因?yàn)橹行男揎椡ǔ?duì)雜交的干擾更大。

生物素和其他親和標(biāo)記本身不會(huì)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。 然而，它們可以啟動(dòng)通過與抗體的高親和力結(jié)合介導(dǎo)的信號(hào)放大，或者在生物素的情況下，通過與鏈霉親和素的高親和力結(jié)合介導(dǎo)的信號(hào)放大。 這些結(jié)合分子可以與酶（例如堿性磷酸酶、過氧化物酶或熒光素酶）連接，從而將單個(gè)目標(biāo)連接到單個(gè)酶。 通過檢測(cè)產(chǎn)生比色、熒光或化學(xué)發(fā)光信號(hào)的酶底物的催化轉(zhuǎn)化來監(jiān)測(cè)酶活性。

親和標(biāo)簽可用于捕獲目標(biāo)并將其定位到固體支持物的區(qū)域。 例如，生物素化探針可以固定至鏈霉親和素包被的表面。 與靶核酸孵育后，添加第二個(gè)探針，該探針可以直接用熒光標(biāo)記或通過另一個(gè)親和標(biāo)記與酶結(jié)合。 試劑的任何背景或非特異性定位都會(huì)導(dǎo)致不需要的信號(hào)與所需的信號(hào)一起放大，并且這些方法通常需要多個(gè)分離和洗滌步驟以降低背景。

熒光標(biāo)簽

寡核苷酸合成和熒光檢測(cè)的進(jìn)步使熒光標(biāo)記探針成為核酸分析的首選報(bào)告基因。 現(xiàn)在有許多熒光標(biāo)記可供使用，允許在 DNA 測(cè)序、片段長(zhǎng)度分析、DNA 陣列和實(shí)時(shí) PCR 等應(yīng)用中進(jìn)行多重顏色分析。 熒光偏振、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）和熒光猝滅等技術(shù)可以提供額外的檢測(cè)特異性。 如果探針的分子旋轉(zhuǎn)在結(jié)合時(shí)發(fā)生變化，則熒光偏振可用于區(qū)分游離標(biāo)記和結(jié)合標(biāo)記。分子旋轉(zhuǎn)主要取決于分子的大小，因此小探針與大目標(biāo)的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致可測(cè)量的偏振增加。 FRET 技術(shù)取決于兩個(gè)光譜不同的熒光標(biāo)記之間的距離。 兩個(gè)標(biāo)記探針可以通過相鄰雜交而靠得更近。 或者，同一探針上的兩個(gè)標(biāo)記可能通過水解或雜交而最終分開得更遠(yuǎn)。 熒光猝滅或增強(qiáng)并不總是需要 FRET。 例如，熒光可能僅通過熒光寡核苷酸與其靶標(biāo)的雜交而改變。 效果取決于染料以及靶標(biāo)和/或探針中 G 殘基的固有猝滅?；蛘撸梢杂幸?/span>地將猝滅部分摻入探針中。

電化學(xué)檢測(cè)

核酸的電化學(xué)檢測(cè)因其簡(jiǎn)單性而具有吸引力。雜交事件可以通過識(shí)別DNA雙鏈的氧化還原指示劑來進(jìn)行檢測(cè)，或者通過其他雜交誘導(dǎo)的電化學(xué)參數(shù)變化，如電導(dǎo)率或電容性來進(jìn)行檢測(cè)。通常，在檢測(cè)之前會(huì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以便提供許多分子并產(chǎn)生大量信號(hào)，從而增加靈敏度。

鑒別技術(shù)

核酸鑒別技術(shù)可分為三類：（1）基于分子大小或形狀的電泳方法，通過物理分離核酸；（2）不使用電泳的替代方法，可確定核酸的大小、堿基含量或序列，包括高效液相色譜（HPLC）、質(zhì)譜和火焰測(cè)序法；以及（3）通過互補(bǔ)核酸的退火或熔化來鑒定特定核酸的雜交檢測(cè)方法。某些技術(shù)同時(shí)使用電泳和雜交。

電泳

DNA 和 RNA 都帶負(fù)電，當(dāng)核酸在適當(dāng)緩沖液中時(shí)，在電場(chǎng)作用下會(huì)向帶正電的電極遷移。 當(dāng)混合物在電場(chǎng)作用下通過中性篩分聚合物時(shí)，就會(huì)發(fā)生不同核酸的分離。 分離主要基于分子大小，較小的分子比較大的分子在聚合物中移動(dòng)得更快（圖 1）。 當(dāng)必須分離非常大的分子 (50 kb) 時(shí)，可以使用脈沖電場(chǎng)幫助這些分子移動(dòng)通過聚合物基質(zhì)。分離也會(huì)根據(jù)分子的物理構(gòu)象或形狀而發(fā)生。 例如，（1）單鏈分子可以折疊成二級(jí)結(jié)構(gòu)，或者它們可以保持為柔性線性結(jié)構(gòu)； (2)線性雙鏈分子可以與堿基錯(cuò)配形成異源雙鏈體，或者它們可以保持其原始同源雙鏈體形式； (3)環(huán)狀雙鏈核酸可以有切口并采取松弛的開環(huán)結(jié)構(gòu)，或者它們可以是更緊湊的超螺旋結(jié)構(gòu)。 在非變性條件下，這些形狀中的每一種都可能影響核酸分子穿過電泳基質(zhì)的方式。 基于形狀的分離可以提供有用的信息，但它也會(huì)混淆基于尺寸的分析。 DNA 電泳根據(jù)應(yīng)用在非變性或變性條件下進(jìn)行。

圖1. 瓊脂糖凝膠電泳后的多個(gè)DNA片段圖像（1% w/v的瓊脂糖凝膠），顯示了通過大小分離雙鏈DNA分子的過程。

RNA 電泳通常作為轉(zhuǎn)錄本定量或微陣列表達(dá)分析之前的質(zhì)量控制檢查進(jìn)行。 RNA 很容易被組織或環(huán)境 RNA 酶降解，因此評(píng)估這些方法中使用的 RNA 的質(zhì)量非常重要。 由于RNA通常具有二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此通常在變性條件下進(jìn)行電泳以消除這些結(jié)構(gòu)。 具有集成微電泳通道的微流控芯片已上市，可通過檢查核糖體 RNA 峰快速評(píng)估 RNA 完整性（圖 2）。 雖然該方法無法檢測(cè)到特定的轉(zhuǎn)錄物，但只需要少量的起始 RNA。

圖2. 人類白細(xì)胞（WBC）RNA的微電泳圖像。在分離WBC并提取總RNA后，樣品被變性，用熒光染料染色，并應(yīng)用于商業(yè)微電泳平臺(tái)，用于評(píng)估RNA的質(zhì)量。顯著的18S和28S核糖體RNA條帶表明RNA基本完整。還顯示了一個(gè)參考標(biāo)記（M）和5S核糖體條帶。請(qǐng)注意，電泳過程在不到1分鐘內(nèi)完成。

瓊脂糖和聚丙烯酰胺是電泳中常用的兩種聚合物。 聚合物的幾種化學(xué)變體可在市場(chǎng)上買到，并針對(duì)不同的分離范圍和應(yīng)用進(jìn)行定制。 聚合物和聚合物濃度（通常表示為 % w/v）的選擇取決于 (1) 待分離核酸的大小，(2) 所需的分辨率，以及 (3) 結(jié)果的可視化方式。 使用不同濃度的瓊脂糖凝膠可以分離小至 20 bp 至大于 10 mb (10,000 kb) 的核酸片段，包括酵母、真菌和寄生蟲的染色體。 然而，瓊脂糖的分辨率是有限的，通常尺寸差異為 2% 至 5%。 瓊脂糖聚合物澆鑄在托盤中（有時(shí)作為預(yù)制凝膠商業(yè)供應(yīng)）并浸沒在緩沖液中。 凝膠可滲透熒光核酸結(jié)合染料，結(jié)果可以記錄為照明下染色凝膠的照片圖像。

聚丙烯酰胺聚合物適用于短分子（高達(dá)約 2 kb）的高分辨率分離（尺寸差異低至約 0.1%），并且是單鏈核酸分離（例如雙脫氧終止測(cè)序）的主要聚合物。 聚丙烯酰胺可以用作線性聚合物溶液，填充在毛細(xì)管中（毛細(xì)管電泳），也可以用作交聯(lián)凝膠，澆注在兩塊塑料或玻璃板之間（平板凝膠電泳）。 聚丙烯酰胺凝膠可滲透熒光染料，核酸也可進(jìn)行銀染。 此外，聚丙烯酰胺聚合物的光學(xué)透明度使其非常適合使用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)來可視化熒光標(biāo)記片段的發(fā)射信號(hào)。 表 1 列出了常見的基于電泳檢測(cè)/分析的技術(shù)。

表1. 電泳應(yīng)用

聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物長(zhǎng)度分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通常通過電泳來分析PCR產(chǎn)物的大小和特異性。擴(kuò)增產(chǎn)物通過熒光DNA結(jié)合染料（如溴化乙錠）染色后，可以在凝膠上觀察。在某些情況下，擴(kuò)增產(chǎn)物的存在直接具有診斷意義（例如，在人體樣本中檢測(cè)僅在細(xì)菌、病毒或真菌中發(fā)現(xiàn)的序列）。擴(kuò)增反應(yīng)的特異性由已知大小和無雜的帶片段來驗(yàn)證。內(nèi)部的陰性和陽性對(duì)照用于控制潛在的污染和PCR抑制物。

通過監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物在凝膠上的長(zhǎng)度，也可以檢測(cè)到小的插入、缺失、重排和重復(fù)序列數(shù)目的變化。長(zhǎng)度差異可以很大，可以通過瓊脂糖凝膠電泳輕松檢測(cè)出來，長(zhǎng)度差異很小則需要用變性聚丙烯酰胺基質(zhì)。在PCR過程中，可以將熒光引物并入產(chǎn)物中，以簡(jiǎn)化片段長(zhǎng)度的檢測(cè)。這些技術(shù)通常在遺傳性疾病的診斷和身份鑒定中使用。

片段長(zhǎng)度多態(tài)性的限制性內(nèi)切酶切割

從細(xì)胞中提取的DNA非常長(zhǎng)，通常在電泳之前會(huì)將其切割成較短的片段，以增強(qiáng)遷移能力。限制性內(nèi)切酶將雙鏈DNA切割成可重復(fù)產(chǎn)生的片段；如果同一酶在不同的樣本中產(chǎn)生相同的片段，說明這些樣本包含相同的DNA序列。如果DNA的改變丟失或引入了一個(gè)內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)（或改變了兩個(gè)切割位點(diǎn)之間的間隔），那么將產(chǎn)生不同大小的片段。由限制性消化引起的片段長(zhǎng)度的變化（或多態(tài)性）稱為限制性內(nèi)切酶切割片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLPs）。由于基因組DNA的限制性消化產(chǎn)生了數(shù)千個(gè)片段，就像Northern和Southern blotting一樣，使用某種標(biāo)記的探針來鑒定目標(biāo)序列是必要的。

聚合酶鏈反應(yīng)/限制性內(nèi)切酶切割片段長(zhǎng)度多態(tài)性

盡管許多序列變異（例如單堿基變化）不會(huì)影響DNA的長(zhǎng)度，但這些變異可能會(huì)創(chuàng)建或破壞內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，如前述所述?？梢允褂肞CR來擴(kuò)增目標(biāo)序列，然后用限制性內(nèi)切酶消化擴(kuò)增產(chǎn)物，以確定限制位點(diǎn)是否已經(jīng)改變。通過對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行簡(jiǎn)單的凝膠電泳，可以確定限制位點(diǎn)的狀態(tài)。例如，如果一個(gè)樣本含有破壞酶識(shí)別位點(diǎn)的變異，這可以與沒有該變異的樣本區(qū)分開來。這種方法將在變異存在時(shí)產(chǎn)生一個(gè)未切割的PCR片段，而在正常DNA中會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)較短的片段（見圖3）。如果變異以雜合子形式存在（一個(gè)正常的和一個(gè)變異的DNA拷貝），則會(huì)觀察到一個(gè)長(zhǎng)片段和兩個(gè)較短片段。通?？梢栽O(shè)計(jì)這種檢測(cè)方法，使得片段可以通過瓊脂糖電泳輕松分辨出來。這種方法的一個(gè)變種使用反轉(zhuǎn)錄的mRNA，它缺乏DNA中存在的內(nèi)含子。通過這種方式，可以在單個(gè)PCR中分析多個(gè)外顯子。

構(gòu)象敏感掃描技術(shù)

在 PCR 擴(kuò)增后，可以使用多種電泳方法通過檢測(cè)單鏈或雙鏈 DNA 的構(gòu)象變化來掃描序列變異。 當(dāng)Sanger測(cè)序被認(rèn)為是識(shí)別遺傳變異的金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，首先篩選樣本并僅對(duì)那些高度懷疑存在變異的樣本進(jìn)行測(cè)序是非常有效的。 單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (SSCP) 分析是通過對(duì)患者樣本和正常對(duì)照樣本的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增來實(shí)現(xiàn)的。 制備患者和正常對(duì)照擴(kuò)增子的混合物并通過煮沸使其變性。 然后將樣品冷卻至室溫，這將導(dǎo)致含有患者和正常擴(kuò)增子鏈的雜交體重新退火。 如果患者樣本中存在變異，則雜交將不是完美的雜交，并且錯(cuò)配會(huì)在雙鏈擴(kuò)增子中產(chǎn)生“氣泡”。 使用改良的聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)，可以將具有變異的擴(kuò)增子與正常對(duì)照擴(kuò)增子和患者擴(kuò)增子區(qū)分開來。 雖然這不會(huì)識(shí)別變異，但它會(huì)識(shí)別哪些患者樣本需要繼續(xù)測(cè)序。 由于測(cè)序成本已大幅下降，這些掃描電泳技術(shù)已不再常規(guī)使用。

圖3. 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）限制性內(nèi)切酶切割片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）的一個(gè)例子。通過PCR擴(kuò)增的DNA片段攜帶一個(gè)被限制性內(nèi)切酶識(shí)別和切割的位點(diǎn)（通常是四個(gè)或更多堿基的唯一序列）。如果存在突變，該位點(diǎn)將被改變，不再被酶識(shí)別。電泳顯示，來自正常樣本的片段確實(shí)被酶切割，生成比原始長(zhǎng)度更短的兩個(gè)片段，但來自純合突變體的片段未被切割，PCR產(chǎn)物的原始長(zhǎng)度被保留。在雜合突變體中，原始片段和較短片段都是可見的。MW代表分子量。

雙脫氧終止測(cè)序（桑格測(cè)序）

DNA的雙脫氧終止測(cè)序常常在臨床實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。RNA也可以用反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)化為DNA來測(cè)序。核酸序列被測(cè)定，并與參考序列進(jìn)行比較，誤差率為0.1%（即在1000個(gè)堿基中有一個(gè)錯(cuò)誤）。通常會(huì)分析序列的兩個(gè)鏈（正義鏈和反義鏈，即雙向），以提高準(zhǔn)確性。使用計(jì)算機(jī)軟件程序來比較序列，可以識(shí)別與參考序列不同的部分。包括不改變蛋白質(zhì)序列的同義突變，以及導(dǎo)致氨基酸改變、過早終止密碼子、剪接變異和小插入缺失等，都可以被識(shí)別出來。

最常見的測(cè)序策略在第一步使用PCR來擴(kuò)增感興趣的區(qū)域，然后使用在20世紀(jì)70年代末開發(fā)的鏈終止反應(yīng)。這個(gè)反應(yīng)通過在鏈延伸過程中從測(cè)序引物中引入四種雙脫氧核苷酸堿基類似物之一，從而產(chǎn)生在不同長(zhǎng)度處終止的片段。雙脫氧核苷酸缺乏核糖環(huán)上的3’-和2’-羥基基團(tuán)（圖4）。因?yàn)镈NA鏈的延伸需要在3’OH基團(tuán)上添加脫氧核苷酸，所以引入雙脫氧核苷酸將終止鏈的延伸。生成這些終止片段的最常見方法是循環(huán)測(cè)序（第二步），通過溫度循環(huán)的退火、鏈延伸-終止和變性等步驟重復(fù)，類似于PCR（圖5）。生成的片段標(biāo)記有熒光染料的終止子雙脫氧核苷酸，通過電泳分離，并在片段經(jīng)過檢測(cè)器時(shí)通過熒光檢測(cè)來檢測(cè)（圖6）。使用不同的熒光標(biāo)簽，每個(gè)核苷酸一個(gè)標(biāo)簽，因此每個(gè)序列只需要一個(gè)通道或毛細(xì)管。在PCR和循環(huán)測(cè)序之后，通過毛細(xì)管電泳可以在不到2小時(shí)內(nèi)分辨出約600到800個(gè)堿基，可以并行運(yùn)行96個(gè)或384個(gè)樣本。

圖4. 雙脫氧核苷酸ddNTP。標(biāo)準(zhǔn)脫氧核苷酸中通常存在 3’-OH。 缺少 3’ -OH會(huì)阻止聚合酶延伸，因?yàn)闊o法形成磷酸二酯鍵。 雙脫氧核苷酸的摻入迫使聚合酶延伸終止。

圖5. 用于測(cè)序的雙脫氧終止反應(yīng)。一段聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）產(chǎn)物被變性并與特定的寡核苷酸引物雜交。當(dāng)DNA聚合酶通過合成與模板互補(bǔ)的堿基（脫氧核苷酸[dNTPs]）來延伸引物時(shí)，它偶爾會(huì)引入終止核苷酸模擬物（ddA、ddG、ddT或ddC），停止進(jìn)一步的延伸。結(jié)果是產(chǎn)生一系列長(zhǎng)度不同的延伸產(chǎn)物的混合物。每個(gè)終止ddNTP可能帶有四種不同的熒光標(biāo)簽之一（在圖示中用不同的符號(hào)表示）。最早的測(cè)序技術(shù)在延伸過程中引入了放射性的dNTP，允許在四個(gè)電泳通道中單色檢測(cè)截?cái)嗥巍?/span>

圖6. 雙脫氧終止DNA測(cè)序的示意圖。延伸產(chǎn)物（見圖5）使用四種不同顏色的終止反應(yīng)染料標(biāo)記，并通過電泳分離以進(jìn)行自動(dòng)終點(diǎn)熒光檢測(cè)（眼睛圖標(biāo)）。片段遷移方向從上到下。在測(cè)序儀生成的電泳圖中，從左到右讀取序列。示例顯示了一個(gè)參考樣本（多態(tài)位點(diǎn)上的純合T）、一個(gè)變異樣本（純合C）和一個(gè)雜合樣本（T和C，報(bào)告為Y）。

臨床實(shí)驗(yàn)室中的RNA測(cè)序通常用于病毒基因分型，例如 HIV 的耐藥性和 HCV 的基因分型，以確定預(yù)后和適當(dāng)?shù)闹委?。測(cè)序還用于通過分析核糖體DNA進(jìn)行細(xì)菌分類，識(shí)別遺傳病變異，以及識(shí)別與癌癥相關(guān)的腫瘤抑制基因和致癌基因變異。即使只對(duì)一個(gè)基因進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)室中的雙脫氧測(cè)序（包括所有外顯子和剪接位點(diǎn)），仍然是一項(xiàng)昂貴的工作，分析成本與基因大小成正比。這對(duì)于人群篩查尤其如此（其中大多數(shù)樣本不會(huì)有突變），但對(duì)于出現(xiàn)疾病癥狀的患者也是如此。大規(guī)模并行測(cè)序大大降低了這些成本，這在前面文章已有討論。

單核苷酸延伸

單核苷酸延伸（Single Nucleotide Extension, SNE）分析，也稱為單堿基引物延伸或微測(cè)序分析，涉及將寡核苷酸引物與單鏈PCR產(chǎn)物在與單個(gè)堿基變異相鄰但不包括變異的位置上退火，然后在聚合酶和雙脫氧核苷酸終止劑存在下，引物進(jìn)行酶催化的延伸（圖7）。例如，每個(gè)四種終止劑都可以用不同的熒光標(biāo)簽標(biāo)記，以便能夠檢測(cè)到哪個(gè)堿基被合并。通過變化引物的長(zhǎng)度，SNE分析可以在毛細(xì)管電泳儀上進(jìn)行多重復(fù)合，從而在一個(gè)電泳運(yùn)行中通過大小分辨率解析每個(gè)SNV。除了電泳，還有許多其他SNE檢測(cè)方法，包括（1）在微孔板上的光度檢測(cè)，（2）DNA陣列上的產(chǎn)物捕獲檢測(cè)系統(tǒng)，（3）通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的珠子雜交分析，（4）基于溶液的熒光極化，和（5）質(zhì)譜。當(dāng)目標(biāo)中包含5到50個(gè)致病性單堿基變異時(shí)，SNE分析尤為有用。如果變異存在于引物結(jié)合位點(diǎn)，SNE分析效果不佳。該法不適用于檢測(cè)緊鄰引物 3’末端以外位置的變異。

圖7. 單核苷酸延伸原理。這種化學(xué)方法基于未標(biāo)記的寡核苷酸引物的雙脫氧單堿基延伸。每個(gè)引物在熒光標(biāo)記的ddNTPs和DNA聚合酶存在下與互補(bǔ)的模板結(jié)合。聚合酶通過一個(gè)核苷酸擴(kuò)展引物，將一個(gè)單個(gè)的ddNTP添加到其3'端。熒光顏色讀數(shù)顯示添加了哪個(gè)堿基。

寡核苷酸連接法

另一種用于變異檢測(cè)的分析方法是寡核苷酸連接法（OLA）。在這種方法中，兩個(gè)寡核苷酸探針與擴(kuò)增的靶DNA相鄰序列雜交，其中變異位點(diǎn)位于一個(gè)探針的末端（如圖8所示）。只有在兩個(gè)探針都與靶標(biāo)完全雜交，包括多態(tài)性堿基，DNA連接酶才能將這兩個(gè)探針共價(jià)連接在一起。通常準(zhǔn)備與正常堿基匹配的探針和與變異堿基匹配的探針，并改變它們的5'尾部長(zhǎng)度來通過差異電泳遷移進(jìn)行區(qū)分。這些尾部可以是非互補(bǔ)的多A或多C尾部，也可以是五乙二醇氧化物（PEO）單元。與兩種等位基因都雜交的探針（常見探針）提供了通常是熒光標(biāo)記的報(bào)告分子。通過將不同的熒光標(biāo)記連接到常見探針上，并通過改變等位基因特異性探針的尾部長(zhǎng)度，可以實(shí)現(xiàn)多重連接。連接后，多個(gè)變異的探針通過變性毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離。

圖8. 寡核苷酸連接法用于雜合單核苷酸變異（SNV）。一個(gè)帶有3’-T（左上角）的突變探針與帶有相對(duì)的A的突變DNA雜交，而帶有3’-C（右上角）的正常探針與帶有相對(duì)的G的正常DNA雜交。這些探針還連接了不同長(zhǎng)度的移動(dòng)修飾尾部（波浪線）。旁邊雜交的是帶有5’-磷酸鹽（Pi）和3’-熒光標(biāo)記的通用探針。在連接酶存在下，相鄰的探針被共價(jià)連接在一起，生成較長(zhǎng)的探針，每個(gè)探針帶有一個(gè)熒光標(biāo)記和一個(gè)移動(dòng)修飾尾部。在其3’端與靶標(biāo)不匹配的探針可能會(huì)雜交，但它們不會(huì)連接。通過終點(diǎn)電泳和激光誘導(dǎo)的連接探針檢測(cè)，可以通過不同的遷移率顯示不同的等位基因。通過改變尾部長(zhǎng)度或使用多色熒光標(biāo)記，可以在一個(gè)電泳分析中分析多個(gè)SNV位點(diǎn)。

多重連接依賴性探針擴(kuò)增

多重連接依賴性探針擴(kuò)增（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification，MLPA）是一種方便的方法，用于相對(duì)定量分析5到50個(gè)目標(biāo)。這個(gè)方法在篩查外顯子、多個(gè)外顯子或整個(gè)基因的缺失或重復(fù)時(shí)特別有用。對(duì)于每個(gè)目標(biāo)，設(shè)計(jì)了兩個(gè)探針，它們相鄰雜交在一起以便進(jìn)行連接。這兩個(gè)探針具有獨(dú)特的尾部，不與目標(biāo)雜交，并且在不同的目標(biāo)之間是相同的。在雜交和連接后，使用一個(gè)共同的引物對(duì)（與尾部互補(bǔ)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中一個(gè)引物在其5'端被標(biāo)記了熒光。由于使用了不同長(zhǎng)度的探針，因此產(chǎn)生了多個(gè)不同大小的PCR產(chǎn)物，并通過毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離。相對(duì)峰高度或面積用于相對(duì)定量比較。

質(zhì)譜分析Mass Spectrometry

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間 (Matrix-assisted  laser-desorption  ionization  time-of-flight，MALDI-TOF) 質(zhì)譜分析可用于對(duì)序列變異進(jìn)行基因分型。對(duì)于質(zhì)譜分析，不需要標(biāo)記，因?yàn)榈任换虻馁|(zhì)量不同。基本過程如下。分離基因組 DNA 后，通過 PCR 擴(kuò)增包含變異位點(diǎn)的特定 DNA 片段。 將不耐熱的堿性磷酸酶添加到反應(yīng)中所有殘留核苷酸去磷酸化，從而防止未來摻入和干擾引物延伸測(cè)定。 然后加熱樣品使堿性磷酸酶失活。 延伸引物直接或緊鄰多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行雜交。 未標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入并用雙脫氧核苷酸終止，產(chǎn)生不同質(zhì)量的等位基因特異性診斷產(chǎn)物。 從樣品中除去鹽，并將大約 10 nL 點(diǎn)樣到涂有 3-羥基吡啶甲酸的陣列上。 將其放入 MALDI-TOF 中，測(cè)量延伸產(chǎn)物的質(zhì)量。 測(cè)量質(zhì)量后，即可確定基因型（圖 9）。 盡管程序很復(fù)雜，但可以自動(dòng)化同時(shí)處理 384 至 1536 個(gè)樣本。 質(zhì)譜的另一個(gè)用途是傳染原鑒定。 PCR 反應(yīng)后，用電噴霧電離質(zhì)譜 (electrospray-ionization mass spectrometry，ESI-MS) 確定 PCR 產(chǎn)物的準(zhǔn)確質(zhì)量，這一過程稱為 PCR/ESI-MS。 由于確定的是質(zhì)量而不是序列，因此存在一定的錯(cuò)誤識(shí)別風(fēng)險(xiǎn)，但可以通過仔細(xì)選擇引物并在必要時(shí)選擇多個(gè)靶標(biāo)來避免這種風(fēng)險(xiǎn)。質(zhì)譜法也可用于檢測(cè)源自單堿基延伸 PCR 測(cè)定的多重產(chǎn)物。

圖9. 質(zhì)譜法進(jìn)行序列多態(tài)性分析。在模板中，被劃線的堿基是多態(tài)性位點(diǎn)（T或C）。單鏈模板在引物、聚合酶、三個(gè)dNTPs和一個(gè)ddNTP的作用下被延伸，生成不同質(zhì)量的片段，這取決于序列。在這個(gè)示例中，方框中的“A”表示已嵌入的終止子腺嘌呤堿基。終止產(chǎn)物的質(zhì)量通過基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行時(shí)間質(zhì)譜精確測(cè)量。插圖中的圖表顯示了相對(duì)強(qiáng)度與m/z的關(guān)系。

高效液相色譜法 High-Performance Liquid Chromatography

HPLC 通常用于分離和純化寡核苷酸。 分離通?；陔x子對(duì)反相色譜法，對(duì)于純化由吸光度和熒光洗脫曲線引導(dǎo)的熒光標(biāo)記探針特別有用。 該技術(shù)的一個(gè)變種是變性 HPLC (denaturing，dHPLC)。 dHPLC 在單一高溫下運(yùn)行以使 dsDNA 部分變性。 與基于凝膠的異源雙鏈體檢測(cè)類似，dHPLC 顯示異源雙鏈體的存在為附加峰，與同源雙鏈體相比，這些峰的保留時(shí)間發(fā)生了移動(dòng)。雙鏈 DNA 的保留受靜電相互作用和乙腈梯度控制。 DNA 檢測(cè)最常通過紫外吸收進(jìn)行，但也可以使用熒光或質(zhì)譜法。 dHPLC 的局限性包括連續(xù)（一次一個(gè)）分析以及當(dāng)存在多個(gè)熔解域時(shí)需要在多個(gè)溫度下分析某些樣品。