慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系構(gòu)建原理知多少？（收藏版）

小波H 2023-10-29 發(fā)布于云南

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// 2022 WINTER

目前用于轉(zhuǎn)染的病毒載體包括γ逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒，腺病毒等，其中γ逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，能夠?qū)⒒蚪MRNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，并且整合到宿主基因組中，從而達到目的基因穩(wěn)定表達的目的。慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構(gòu)建主要分為病毒包裝和慢病毒感染細胞兩個部分。

實驗操作基本流程（以第三代慢病毒載體為準）

一、病毒包裝

1. 構(gòu)建四種質(zhì)粒

包裝質(zhì)粒（攜帶gag基因和pol基因）

質(zhì)粒（攜帶env或VSV-G基因）

質(zhì)粒（攜帶rev基因）

載體質(zhì)粒（攜帶LTR，ψ，RRE和包含內(nèi)部啟動子的目的基因）

2. 準備HEK293T細胞（工具細胞）

3. 通過瞬轉(zhuǎn)方式（比如脂質(zhì)運載體，磷酸鈣沉淀法等）使四種質(zhì)粒進入HEK293T細胞中

4. 在轉(zhuǎn)染后48小時和72小時收集病毒上清液（可直接感染或濃縮后感染）

二、慢病毒感染細胞

1. 向細胞中加入病毒液

2. 抗生素篩選出穩(wěn)定表達目的基因的細胞系

實驗操作基本原理

一、 HIV病毒

HIV病毒包括RNA基因組和蛋白成分。基因組可以編碼九種病毒蛋白；基因組兩側(cè)是長末端重復序列（Long Terminal Repeats, LTR），主要由U3（啟動子），R（轉(zhuǎn)錄起始位點）和U5（逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)位點）組成，是病毒逆轉(zhuǎn)錄，整合和轉(zhuǎn)錄所需的順式作用元件；在LTR和蛋白翻譯基因之間有“ψ”和RRE，“ψ”作為基因組二聚化和包裝信號；RRE促進病毒基因組有效運輸?shù)郊毎|(zhì)中進行高效包裝。HIV病毒進入宿主細胞中，通過逆轉(zhuǎn)錄酶將LTR之間的序列逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，然后通過整合酶將雙鏈DNA整合到宿主基因組中。5’LTR傾向于將基因組整合到宿主基因組轉(zhuǎn)錄比較活躍的位點，3’LTR介導RNA 3’端多聚腺苷酸的形成，以穩(wěn)定RNA序列。

二、慢病毒載體

人為構(gòu)建載體質(zhì)粒，將LTR序列之間的病毒基因組替換成目的基因，利用HIV病毒的逆轉(zhuǎn)錄和整合功能將目的基因插入宿主基因組中。由于病毒基因組被替換掉，因此需要其他質(zhì)粒來表達病毒實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄，整合和轉(zhuǎn)錄等功能所需的功能蛋白，即包裝質(zhì)粒（攜帶gag基因和pol基因），質(zhì)粒（攜帶env或VSV-G基因）和質(zhì)粒（攜帶rev基因）；質(zhì)粒所攜帶的基因功能如表1所示。其中env基因一般替換成VSV-G基因，主要是因為env蛋白只能與CD4受體結(jié)合，而VSV-G具有廣泛親嗜性，可以與多數(shù)細胞表面分子結(jié)合，擴大了慢病毒感染細胞類型，同時可以提高病毒顆粒的穩(wěn)定性，尤其是高速離心過程中病毒顆粒的穩(wěn)定。

1. 病毒包裝

這一過程是在HEK293T細胞中實現(xiàn)的。

質(zhì)粒進入細胞核中，在細胞核中完成轉(zhuǎn)錄，在細胞質(zhì)中完成翻譯，包裝質(zhì)粒（攜帶gag基因和pol基因）用于合成病毒的基質(zhì)蛋白，衣殼蛋白和核衣殼蛋白等核心蛋白成分（gag基因編碼蛋白）以及蛋白酶，逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶等（pol基因編碼蛋白）；質(zhì)粒（攜帶env或VSV-G基因）用于合成蛋白的外膜蛋白（env/vsv-g編碼蛋白），用于病毒融合并進入細胞內(nèi)；質(zhì)粒（攜帶rev基因）用于合成rev蛋白；載體質(zhì)粒（攜帶LTR，ψ，RRE，包含內(nèi)部啟動子的目的基因）用于轉(zhuǎn)錄出病毒的RNA基因組，包括LTR，ψ，RRE和目的基因的mRNA序列。RRE促進病毒基因組運輸?shù)郊毎|(zhì)中實現(xiàn)高效包裝的；ψ為包裝信號，引起病毒的包裝；最終包裝的病毒顆粒中有RNA基因組和功能蛋白（gag，pol，env/vsv-g，rev）。

此外第三代使用強異源啟動子替代5’LTR的U3啟動子，可以顯著提高病毒RNA基因組的轉(zhuǎn)錄，從而增加病毒滴度。最終從上清液中獲取包裝好的病毒顆粒。雖然病毒包裝這一步的完成暫且不需要整合功能，但病毒基因組難以避免的會整合到HEK293T細胞基因組中，因此完成病毒包裝的HEK293T細胞會被丟棄。

2. 慢病毒感染細胞

使用病毒上清液（病毒顆粒）感染目的細胞，只有一次感染能力，而無復制能力，外膜蛋白協(xié)助病毒進入細胞中，同時完成病毒脫殼，病毒顆粒中的RNA基因組和蛋白成分分散在目的細胞質(zhì)中。RNA基因組在細胞質(zhì)中進行逆轉(zhuǎn)錄過程，生成雙鏈DNA（前病毒DNA），由逆轉(zhuǎn)錄酶，整合酶，VPR，基質(zhì)蛋白和前病毒DNA組成前整合復合物，穿過核孔（而γ逆轉(zhuǎn)錄病毒只能在核膜溶解的情況下進入細胞核中，因此只能感染分裂細胞），進入細胞核中。在整合酶的作用下，前整合DNA被整合到宿主基因組中，整合進去的目的基因的表達由內(nèi)部的強異源啟動子驅(qū)動，而非U3，因為U3屬于弱啟動子，需要tat激活才能放大效應，而我們構(gòu)建的慢病毒載體中沒有tat基因。此外，第三代使用SIN（自我滅活）替代3’LTR的U3結(jié)構(gòu)，逆轉(zhuǎn)錄使SIN成為前病毒DNA（即整合到宿主基因組的載體序列） 5’LTR的啟動子，從而喪失從此部位啟動轉(zhuǎn)錄的活性。