聯(lián)合國糖尿病日——糖尿病用藥及其PK/PD研究###

前言

2022年11月14日是第16個聯(lián)合國糖尿病日，本期主題是“人人享有糖尿病健康管理”。聯(lián)合國糖尿病日的前身是世界糖尿病日（World Diabetes Day），該活動由世界衛(wèi)生組織和國際糖尿病聯(lián)盟于1991年共同發(fā)起，從2007年更名為聯(lián)合國糖尿病日，其宗旨是引起全球?qū)μ悄虿〉木X和醒悟。糖尿病在我國是高發(fā)病，患上了糖尿病需要終身治療。因此糖尿病用藥的研發(fā)對于改善患者生活、減輕疾病負擔具有重要意義，而生物分析是糖尿病用藥研究進程中不可或缺的一環(huán)。

糖尿病介紹

糖尿病是由于胰島素分泌及（或）作用缺陷引起的以血糖升高為特征的代謝病。糖尿病的典型癥狀是“三多一少”（多飲、多食、多尿、體重減輕），出現(xiàn)糖尿病典型癥狀并符合以下任何一個條件的人，可以診斷為糖尿病[1]:

（1）一天中任一時間血糖≥11.1mmol/L(200mg/dl)；

（2）空腹血糖水平≥7.0mmol/L(126mg/dl)；

（3）口服葡萄糖耐量試驗2小時血糖水平≥11.1mmol/L（200mg/dl）。

具備以下因素之一，即為糖尿病高危人群：

（1）年齡≥40歲；

（2）超重與肥胖；

（3）高血壓；

（4）血脂異常；

（5）靜坐生活方式；

（6）糖尿病家族史；

（7）妊娠糖尿病史；

（8）巨大兒（出生體重≥4Kg）生育史。

另外，6.1 mmol/L≤空腹血糖（FBG）

糖尿病患者常伴有脂肪、蛋白質(zhì)代謝異常，長期高血糖可引起多種器官，尤其是眼、心、血管、腎、神經(jīng)損害或器官功能不全或衰竭，導(dǎo)致殘廢或者過早死亡。糖尿病常見并發(fā)癥包括卒中、心肌梗死、視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、糖尿病足等。

糖尿病用藥分類

目前，我國糖尿病分型是根據(jù)世界衛(wèi)生組織在1999年的分型體系來劃分的，有4種類型：1型糖尿病、2型糖尿病、特殊類型糖尿病、妊娠期糖尿病。1型糖尿病的主要病因是由于自身免疫對胰島 β細胞破壞后造成胰島素分泌的絕對缺乏，故 1型糖尿病患者需要胰島素治療來維持生命；2型糖尿病的發(fā)生是由于胰島素分泌減少或是胰島素抵抗，可表現(xiàn)為以胰島素抵抗為主伴胰島素相對缺乏，或胰島素分泌缺陷為主伴或不伴胰島素抵抗。治療糖尿病的藥物有胰島素制劑和口服降糖藥。

胰島素制劑根據(jù)其作用時間及特點分類如下【2】：

（1）速效人胰島素類似物。利用重組DNA技術(shù)，通過修飾人胰島素的氨基酸序列而生成的。如門冬胰島素和賴脯胰島素。

（2）短效胰島素制劑，即普通胰島素。目前有動物來源和重組人胰島素。

（3）中效胰島素，即低精蛋白鋅胰島素，是將胰島素與鋅和魚精蛋白磷酸緩沖液混合制成的混懸劑。

（4）長效胰島素制劑，即精蛋白鋅胰島素。

（5）超長效胰島素制劑類似物，有甘精胰島素和地特胰島素，具有長效、平衡的特點，無峰值血藥濃度。而德谷胰島素作用時間長達42小時，注射時間靈活，間隔8-40小時均可。

（6）預(yù)混胰島素，是含有短效和中效胰島素制劑的混合物。

圖1 胰島素及其類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu):(a)人胰島素；(b)賴脯胰島素；(c)甘精胰島素；(d)門冬胰島素；(e)地特胰島素；(f)賴谷胰島素；(g)德谷胰島素[2]

口服降糖藥根據(jù)作用機制分類如下：

（1）磺酰脲類促胰島素分泌藥，主要選擇性地作用于胰島β細胞，促進胰島素的分泌，代表藥物有格列本脲、格列吡嗪、格列美脲、格列齊特、格列喹酮。

（2）非磺酰脲類促胰島素分泌藥，如瑞格列奈和那格列奈。為新型的短效口服促胰島素分泌降糖藥，促胰島素分泌作用較磺酰脲類快。

（3）雙胍類藥，如二甲雙胍，可減少糖原生成和增加葡萄糖的外周利用而降低血糖。

（4）α-葡萄糖苷酶抑制劑，如阿卡波糖、伏格列波糖，其在腸道內(nèi)競爭性抑制α-葡萄糖苷苷酶的活性而減少淀粉的消化和吸收。

（5）胰島素增敏劑，如羅格列酮和吡格列酮，可改善外周性胰島素抵抗而降低血糖。

（6）醛糖還原酶抑制劑，如依帕司他，用于糖尿病神經(jīng)病變。

（7）DPP-IV抑制劑類降糖新藥。當人體進餐后，小腸會分泌腸促胰島素，包括胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素多肽（GIP）等，促進β細胞分泌胰島素，從而降低血糖。而血液中分泌的DPP-Ⅳ（腸促胰島素類二肽基肽酶Ⅳ）會分解GLP-1和GIP，導(dǎo)致腸促胰島素失效，這種情況在2型糖尿病患者中十分常見。DPP-Ⅳ 抑制劑能夠抑制DPP-Ⅳ發(fā)生作用，增強和延長活性腸促胰島素的水平，防止2型糖尿病患者餐后血糖升高。抑制劑類口服降糖新藥, 如盛格列汀，可以通過減緩腸促胰島素的滅活在2型糖尿病患者中發(fā)揮降糖作用。

胰島素類藥物國內(nèi)外研究進展

圖2 胰島素類藥物的發(fā)展史[3]

1889年，德國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)移除狗的胰腺，會導(dǎo)致糖尿病，因此首次證明胰腺與糖尿病的相關(guān)性。其后從胰島素的發(fā)現(xiàn)、動物胰島素的提取、再到人胰島素氨基酸序列的確定僅僅經(jīng)歷了不到五十年的時間。20世紀80年代至21世紀初，胰島素的研究也經(jīng)歷了歷史性的突破進展。通過基因工程技術(shù)規(guī)?；a(chǎn)人胰島素，后又通過對胰島素結(jié)構(gòu)的修飾或改變其理化性質(zhì)，開發(fā)出了胰島素類似物，使其更符合生理需要。與此同時，中國藥企在胰島素研究方面也取得了長足的發(fā)展。甘李藥業(yè)、通化東寶、江蘇萬邦、珠海聯(lián)邦、宜昌東陽光、合肥天麥等多家公司均在胰島素賽道上取得不斐的業(yè)績。

胰島素類藥物的代謝排泄

不同類型胰島素在皮下的溶解、解離、擴散速度不同，導(dǎo)致起效時間、達峰時間、維持時間也有所不同。胰島素皮下注射后在皮下形成儲存池，偏酸性的胰島素在人體生理偏堿性的環(huán)境中會在儲存池中形成沉淀，并緩慢再溶解、釋放，最終和外周細胞胞膜上的胰島素受體結(jié)合[4]。

胰島素類藥物的代謝途徑通常與內(nèi)源性多肽的代謝途徑相同，代謝產(chǎn)生的氨基酸在內(nèi)源性氨基酸庫中被重新利用，用于蛋白質(zhì)/肽的從頭合成。血液、肝臟、腎臟和小腸可能是胰島素類藥物降解的重要部位，因為它們富含各種蛋白酶和肽酶。但由于體內(nèi)的蛋白酶和肽酶無處不在，體內(nèi)其他各組織中也都存在多肽的降解。甘精胰島素會被代謝成M1和 M2，其中M1是最主要的代謝產(chǎn)物。M1和M2均有較弱地與胰島素樣生長因子受體（IGF-1R）結(jié)合的能力。

通常情況下，胰島素類藥物的分子量通常都在10 kDa以下，可被腎小球過濾，然后在近端小管細胞刷狀邊緣被降解，其腎臟清除率接近腎小球的濾過效率。

糖尿病用藥的生物分析

藥物的治療成功與否取決于藥物的作用機制、患者的依從性以及合適的血藥濃度。后兩個因素可以通過生物分析方法進行評估。生物分析可以用于確定生物基質(zhì)中的藥物和/或代謝物的濃度，在藥代動力學(xué)、藥效學(xué)、治療性藥物監(jiān)測（TDM）、生物利用度、生物等效性和毒理學(xué)研究方面發(fā)揮著重要作用。

5.1 胰島素類藥物的生物分析

胰島素類藥物的分析方法根據(jù)原理大致可分為三類：免疫分析法、色譜法和電化學(xué)生物傳感器。免疫分析法包括ELISA, AlphaLISA, HTRF, CLIA，RIA等。色譜法包括MECC（膠束電動毛細管色譜法）和LC-MS/MS。電化學(xué)生物傳感器是一種基于電流和/或電壓檢測分析物結(jié)合的類型。隨著對胰島素及其類似物或代謝物研究需求的增加，色譜方法也不斷地發(fā)展，以實現(xiàn)胰島素與其主要降解產(chǎn)物或其類似物藥物之間的充分分辨。本文主要介紹色譜法分析胰島素類藥物。

表·1 基于色譜法的胰島素測定方法綜述[2]

色譜方法的機制是基于柱分離輔助高效液相色譜（HPLC）或電泳和鑒定使用紫外（UV）檢測器和質(zhì)譜（MS）。分析前不同的樣品提取程序也為胰島素測定提供了不同的選擇性和敏感性。LC-MS/MS可用于定量生物基質(zhì)中的治療性蛋白/多肽和生物標志物。LC-MS/MS具有特異性高、選擇性強、動態(tài)范圍寬、抗干擾能力強等優(yōu)點。一般來說，有兩種方法來定量蛋白質(zhì)：自上而下的方法用于研究完整的蛋白質(zhì)，而自下而上的方法測量蛋白質(zhì)的酶消化產(chǎn)生的肽。但使用LC-MS/MS檢測胰島素時存在運行時間長和分辨率低的缺點，而UPLC-MS/MS則解決了這個問題。還有文獻報道[5]，與RIA相比，UPLC-MS/MS在檢測甘精胰島素及其代謝產(chǎn)物M1和M2時有更高的靈敏度和穩(wěn)定性，同時還對內(nèi)源性胰島素、外源性胰島素類似物的干擾具有較好的特異性優(yōu)勢。

UPLC-MS/MS方法的技術(shù)難點

該類項目對實驗室質(zhì)譜平臺的綜合能力提出了巨大挑戰(zhàn)：

（1）首先是對于儀器系統(tǒng)整體性能、穩(wěn)定性及靈敏度有很高要求，該類藥物質(zhì)譜多電荷帶電，特殊的流動性條件致使信號響應(yīng)低，所以儀器靈敏度要高且信號穩(wěn)定，強吸附性需要儀器液相系統(tǒng)硬件有抗吸附功能，否則殘留無法通過；

（2） 該類化合物吸附性嚴重，在方法驗證及樣品分析過程中，儀器清洗維護至關(guān)重要，設(shè)備管理人員需要敏銳觀測儀器信號穩(wěn)定性，密切配合項目組及時清洗重要配件，才能保證項目順利開展，如遇到嚴重吸附污染，則需要儀器廠商高效協(xié)同解決；

（3） 生物基質(zhì)干擾嚴重，需要優(yōu)選色譜柱，優(yōu)化良好的梯度條件，與基質(zhì)中多種干擾物的分離，確保數(shù)據(jù)科學(xué)準確；

（4） 色譜柱消耗量大，色譜柱需要老化和平衡沖洗，確保同一PN序列號色譜柱各分析批及不同PN序列號色譜柱重現(xiàn)性及分析批的成功；

（5） 樣品處理過程需要特殊的方法，提高回收率，保證信號穩(wěn)定可重現(xiàn)，樣品處理全程需要特殊試劑進行抗吸附，否則線性等指標很難成功；

（6） 項目運行過程需要高級別項目負責人及操作經(jīng)驗熟練分析人員密切配合才能順利進行。

經(jīng)典案例一

甘精胰島素由53個氨基酸組成，分子量為6063 Da，用于治療2型糖尿病。在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為有活性的代謝產(chǎn)物M1和M2。若采用放射免疫分析法，無法區(qū)分原型和代謝物。陽光德美質(zhì)譜平臺技術(shù)團隊采用Waters TQ-XS則可對原型和代謝物進行定量分析。通過設(shè)置正離子掃描模式、MRM檢測方式以及離子對進行定量檢測。另外采用特殊溶劑以解決非特異性吸附的問題。用固相萃取的方法進行前處理，實現(xiàn)了原型和代謝物的靈敏度均達到0.0500 ng/mL。驗證結(jié)果表明各離子對之間沒有相互干擾，特異性好，線性在0.0500~10.0 ng/mL范圍內(nèi)，線性良好，批內(nèi)批間精密度和準確度均符合要求，沒有殘留和基質(zhì)效應(yīng)，回收率穩(wěn)定，方法成功地應(yīng)用于臨床樣品檢測。

圖3 甘精胰島素質(zhì)譜圖、色譜圖和Waters TQ-XS

圖4 甘精胰島素藥時曲線圖

經(jīng)典案例二

賴脯胰島素屬于速效人胰島素類似物，可以用于治療1型和2型糖尿病。使用成熟高效的UPLC-MS/MS的檢測方法，通過設(shè)置正離子掃描模式、MRM檢測方式以及離子對進行定量檢測。采用特殊溶劑以解決非特異性吸附的問題。采用經(jīng)開發(fā)優(yōu)化的梯度條件，用固相萃取的方法進行前處理，驗證結(jié)果表明各離子對之間沒有相互干擾，特異性好，線性在0.100~80.0 ng/mL范圍內(nèi)，線性良好，批內(nèi)批間精密度和準確度均符合要求，沒有殘留和基質(zhì)效應(yīng)，回收率穩(wěn)定。

圖5 賴脯胰島素藥時曲線圖[6](Ly-Lis-JP為參比制劑優(yōu)泌樂，SAR-Lis為受試制劑）

表2 賴脯胰島素PK/PD結(jié)果[6]

5.2 口服降糖藥的生物分析

口服降糖藥一般可以采用HPLC-MS/MS進行檢測。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是將色譜分離技術(shù)與質(zhì)譜檢測技術(shù)兩者相結(jié)合，兼具色譜的分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度、高特異性以及抗干擾能力強等特點，可以應(yīng)對多種復(fù)雜組分的快速檢測、鑒定和準確定量，使其在藥代動力學(xué)研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。據(jù)文獻報道[3]可在同一色譜系統(tǒng)同時檢測二甲雙胍、格列喹酮、格列美脲等11種降糖類化合物。

經(jīng)典案例三

盛格列汀作為腸促胰島素類二肽基肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制劑類口服降糖新藥,可以通過減緩腸促胰島素的滅活在2型糖尿病患者中發(fā)揮降糖作用，前期試驗數(shù)據(jù)表明盛格列汀在2型糖尿病中的療效可期，安全可靠。陽光德美開發(fā)并驗證了具有高靈敏度、高特異性的高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）定量分析方法，分別測定人血漿、尿液、糞便樣本中磷酸盛格列汀原型藥物和陽性對照藥物（西格列汀）的濃度。因盛格列汀屬于I類新藥，方法開發(fā)難度大，項目負責人通過查閱大量同類藥物相關(guān)文獻，結(jié)合臨床前相關(guān)資料，推斷新藥系統(tǒng)暴露，順利完成方法開發(fā)及符合國內(nèi)外法規(guī)要求的方法學(xué)驗證，并應(yīng)用于臨床研究，為后期臨床研究提供數(shù)據(jù)支持，為闡明盛格列汀系統(tǒng)暴露與藥效的關(guān)系研究提供科學(xué)參考。盛格列汀的代謝產(chǎn)物互為同分異構(gòu)體是其代謝的一大特點，同時也增加了分析的難度。陽光德美采用高分辨質(zhì)譜Q-TOF，憑借著豐富的質(zhì)譜解析經(jīng)驗，對盛格列汀存在于人血漿、尿液、糞便樣本中共11個代謝產(chǎn)物進行鑒定，并推斷出了可能的質(zhì)譜裂解途徑，從而總結(jié)了盛格列汀在人體內(nèi)主要的代謝途徑，為解釋盛格列汀藥效研究和安全性評價的物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。

在盛格列汀項目運行過程中，德美醫(yī)藥進行了有效的項目管理和積極地溝通，不分節(jié)假日，做到生物樣品隨到隨測。為盡早對藥物劑量組的安全性和受試者的耐受性進行藥學(xué)分析，指導(dǎo)后期試驗的劑量選擇爭取時間，快速高效的完成盛格列汀的I期臨床研究工作，極大推進了盛格列汀的研發(fā)進程。

德美醫(yī)藥通過臨床定量藥理模型，合理預(yù)測了盛格列汀開展Ⅲ期臨床可能的臨床推薦劑量，使得其于2019年11月得到國家藥品審評中心的“豁免II期臨床直接進入III期試驗”的正式批復(fù)，成為全球首個通過定量藥理模型，豁免II期臨床，直接開展Ⅲ期驗證性試驗的DPP-IV抑制劑，受到了國內(nèi)外糖尿病領(lǐng)域?qū)＜业母叨汝P(guān)注。

結(jié)語

近年來，隨著糖尿病研究的不斷深入以及新藥的研發(fā)，極大地改善了糖尿病人群的生活。相信在不遠的未來，會有越來越多優(yōu)秀的降糖藥物出現(xiàn)，為患者提供更多更好的治療選擇。全面了解降糖藥物的生物分析，對于設(shè)計更好的降糖藥物和更好地控制不良反應(yīng)具有重要意義。

陽光德美在2019年開始建立肽類藥物及核酸類藥物PK、PD、ADA研究服務(wù)平臺，從軟硬件建設(shè)，人員團隊能力建設(shè)，質(zhì)量體系建設(shè)，項目管理等多維度下功夫，目前已成功開發(fā)并實際應(yīng)用I期臨床研究中多種肽類藥物方法、反義核酸藥物方法，包括在胰島素類藥物的生物分析方面有著豐富的經(jīng)驗。目前在肽類藥物及核酸類藥物方面服務(wù)于國內(nèi)胰島素頭部企業(yè)，國內(nèi)大型綜合型藥企的核酸平臺品種及多家新型Biotech肽類企業(yè)。陽光德美一直秉持著“質(zhì)量是陽光德美的立身之本，效率是陽光德美的強身之道”的信念。在未來的發(fā)展中，陽光德美將一如既往地以科學(xué)、高效、準確的精神為指導(dǎo)，領(lǐng)先行業(yè)、創(chuàng)譽中外，與社會各界朋友精誠合作，攜手奮進，共創(chuàng)生物樣品分析領(lǐng)域更加輝煌的明天。