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/ 前言 / 報告基因是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中用于潛在的順式元件和反式作用因子相互作用關(guān)系的一種重要工具，被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、啟動子分析、受體功能鑒定、基因治療以及藥物篩選等領(lǐng)域。 熒光素酶是科研中運用最廣泛的報告基因之一，其具有檢測靈敏度高、結(jié)果重復(fù)性好、信噪比較高和易于檢測等特點。 / 實驗原理 / 熒光素酶是生物體內(nèi)催化熒光素（luciferin）或脂肪醛（firefly aldehyde）氧化發(fā)光的一類酶的總稱，來自于自然界能夠發(fā)光的生物。自然界存在的熒光素酶多來自螢火蟲、發(fā)光細(xì)菌、發(fā)光海星、發(fā)光節(jié)蟲、發(fā)光魚、發(fā)光甲蟲等。熒光素酶的種類很多，其中應(yīng)用較為廣泛的是螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase，F(xiàn)LUC）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase，RLUC）。 / 雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)（Dual-Luciferase reporter assay）/ 雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)在細(xì)胞中同時表達(dá)螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶，兩者可催化各自的底物發(fā)生氧化作用產(chǎn)生生物熒光，以螢火蟲螢光素酶為核心reporter，海腎熒光素酶作為內(nèi)參（注1），構(gòu)建研究對象到相應(yīng)位置，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，裂解細(xì)胞，分別加熒光素酶底物，用熒光測定儀檢測熒光強度，通過數(shù)據(jù)得出基因表達(dá)量，從而確定構(gòu)建序列的功能。雙報告基因則通過共轉(zhuǎn)染的“對照”作為內(nèi)參為試驗提供基準(zhǔn)線，從而可以在最大程度上減小細(xì)胞生長狀況、細(xì)胞數(shù)目以及轉(zhuǎn)染效率等外在因素對實驗的影響，使得數(shù)據(jù)結(jié)果更為可信。 注1：內(nèi)參根據(jù)雙熒光載體的不同而有所不同，并非固定不變。  圖1. 熒光素酶發(fā)光原理。（A）螢火蟲熒光素酶催化反應(yīng)原理；（B）海腎熒光素酶催化反應(yīng)原理。 / 載體選擇 / 雙熒光素酶報告基因檢測常用的載體有兩種策略。第一種是兩種熒光素分別位于兩個載體上，即將帶有海腎熒光素酶基因的質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞；第二種是兩種熒光素酶位于同一個載體上，兩種熒光素酶分別用不同的啟動子啟動其表達(dá)。 (1) 雙載體系列（兩種熒光素酶分別位于兩個載體上）： 目前，常用的F-Luc載體大多以pMIR-REPORT載體、pGL3系列載體為主；R-Luc載體大多以pRL系列載體為主。 1) pMIR-REPORT載體 2) pGL3系列載體 PGL3系列載體包括Promoter、Enhancer、Basic以及Control，都含有螢火蟲熒光素酶報告基因，其中Control為對照載體；Basic僅含有一個Luc基因，無啟動子與增強子；Promoter含有SV40啟動子，可用于檢測增強子；Enhancer則與之相反，即含有增強子，可用于檢測啟動子。 3) pRL系列載體 pRL系列載體為海腎熒光素酶報告載體，由Promega公司開發(fā)，其載體間最主要的區(qū)別是攜帶的啟動子不同，包括CMV、SV40、TK等，即pRL-CMV、pRL-SV40、載體，將F-Luc載體與其共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞時，pRL系列載體起發(fā)揮內(nèi)參作用。 (2) 單載體系列（兩種熒光素酶位于同一個載體上）： 1) pmirGLO載體 pmirGLO是由普洛麥格（Promega）開發(fā)的，目前常用的一種商品化雙熒光素酶報告載體。pmirGLO是設(shè)計用于定量分析miRNA活動的雙熒光素酶報告載體，將螢火蟲熒光素酶基因（luc2）和海腎熒光素酶基因（hRluc-neo）構(gòu)建在一個載體上。螢火蟲熒光素酶基因的3’端有一個多重克隆區(qū)域（MCS區(qū)域），這個區(qū)域中含有多個酶切位點，通過酶切連接過程可以插入miRNA靶點序列或者感興趣基因的3’非編碼區(qū)，用于研究轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性和活性。  圖2. pmirGLO載體圖譜 2) psiCHECK系列載體 psiCHECK?-2載體旨在為RNA干擾(RNAi)的優(yōu)化提供定量和快速的方法。該載體能夠監(jiān)測融合到報告基因的靶基因表達(dá)的變化。在這兩種載體中，Renilla熒光素酶作為一級報告基因，目標(biāo)基因可以克隆到位于Renilla熒光素酶翻譯終止密碼子下游的多個克隆區(qū)。對感興趣基因的RNAi過程的啟動導(dǎo)致融合mRNA的裂解和隨后的降解。海腎熒光素酶活性降低的測量是RNAi效應(yīng)的方便指標(biāo)。 
圖3. psiCHECK2載體圖譜 / 應(yīng)用范圍 / 1）驗證mRNA/lncRNA/circRNA與miRNA靶向互作; 2）驗證轉(zhuǎn)錄因子與啟動子互相作用； 3）驗證轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點； 4）啟動子結(jié)構(gòu)分析或啟動子SNP分析； 5）誘導(dǎo)因素對啟動子活性調(diào)節(jié)研究； 6）研究分析信號通路是否激活。 / 優(yōu)點 / 1) 易表達(dá)：無需表達(dá)后修飾，直接具有可被檢測的酶活； 2) 高靈敏度：在所有的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，它的光產(chǎn)物具有最高的量子效率，因而非常靈敏。另外，在宿主細(xì)胞及檢測試劑中均檢測不到背景發(fā)光； 3) 低背景：哺乳動物無內(nèi)源性熒光素酶表達(dá)； 4) 高效，通量大：檢測快速，每個樣品只需幾秒鐘； 5) 與綠色熒光蛋白（GFP）不同，它們的發(fā)光檢測不需要激發(fā)光激發(fā)，且發(fā)光穿透力更強。 / 實驗流程 / 1) miRNA oligo合成； 2) 重組質(zhì)粒制備：將相應(yīng)的基因片段構(gòu)建入載體構(gòu)建重組質(zhì)粒； 3) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用于miRNA靶標(biāo)檢測的重組質(zhì)粒和miRNA共轉(zhuǎn)染，通常在24~48 h后進(jìn)行檢測； 4) 細(xì)胞處理：細(xì)胞裂解和加入熒光素酶檢測試劑等操作依照雙熒光素酶檢測試劑盒操作； 5) 熒光檢測：使用酶標(biāo)儀或具有類似功能的設(shè)備進(jìn)行熒光強度檢測； 6) 數(shù)據(jù)分析。 / 舒桐雙熒光素酶報告基因檢測服務(wù)優(yōu)勢 / 1）載體庫全，可根據(jù)客戶不同實驗需求構(gòu)建報告檢測重組載體； 2）服務(wù)周期短，從載體構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、雙熒光檢測，整個流程20天內(nèi)完成（可提供加急服務(wù)）； 3）至少3個生物學(xué)重復(fù)，檢測更可靠； 4）提供原始數(shù)據(jù)和可視化結(jié)題報告。 關(guān)于舒桐 如需獲得更多信息，請咨詢我們： 電話： 400-6309596 15022705442（同微信） 企業(yè)官網(wǎng)： http://www. 產(chǎn)品訂購/技術(shù)支持： service@ 參考文獻(xiàn)： 1. Sherf, B.A. et al. (1996) Dual-Luciferase? reporter assay: An advanced co-reporter technology integrating firefly and Renilla luciferase assays. Promega Notes 57, 2–9. 2. Wood, K.V. et al. (1984) Synthesis of active firefly luciferase by in vitro translation of RNA obtained from adult lanterns. Biochem. Biophys. Res. Comm. 124, 592–6. 3. Lorenz, W.W. et al. (1991) Isolation and expression of a cDNA encoding Renilla reniformis luciferase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4438–42. |
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