簡介：本文靈感來自于《藥品微生物實驗室消毒劑效力評估指導(dǎo)原則草案公示稿》（第一次），本文將對相關(guān)參考法規(guī)、消毒劑選擇、中和劑效力驗證、消毒劑效力評估、消毒劑殘留、消毒劑存放效期等相關(guān)內(nèi)容的的個人思考進行分享，具體流程參見下圖。

清潔消毒程序建立流程圖（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)，僅供學(xué)習(xí)交流用）

1、消毒劑相關(guān)法規(guī)

關(guān)于消毒及相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)要求參考GMP指南，對于具體的消毒劑效力驗證參考JP17、USP1072及相行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或國家標(biāo)準(zhǔn)。其中個人推薦參考內(nèi)容較為全面的PDA TR70。

2、消毒劑的選擇

根據(jù)我們?nèi)粘Ｏ拘枨螅ㄈ缧陆◤S房）確定消毒劑的強度和廣度后需要進行供應(yīng)商的選擇和消毒劑評估（本文不涉及消毒程序細節(jié)）。

消毒劑選擇時我們需要對我們所用消毒劑的類型、作用機制及作用濃度有基礎(chǔ)了解。特別注意其定位是殺孢子劑還是非殺孢子劑。

了解消毒劑基礎(chǔ)信息后接下來就是消毒劑的選擇，消毒劑選擇需要考慮內(nèi)容見下圖，特別強調(diào)下注意選擇濃縮型消毒劑時注意正確配制和使用。對于細節(jié)，如不過于計較成本，在了解下圖的基礎(chǔ)上讓供應(yīng)商幫你選擇即可，也可以參考??收藏 | 潔凈區(qū)清潔消毒必須要知道的事

接下來是供應(yīng)商的選擇，讓我們的消毒劑供應(yīng)商卷起來，供應(yīng)商越給力，我們越輕松（前提是有錢），供應(yīng)商需要為我們提供下圖這些信息。當(dāng)然如果我們的消毒劑都是自制的，我們要自行收集相關(guān)信息。

基于已獲取的信息和清潔消毒對象（被消毒表面、潔凈級別、微生物種類等），我們需進行相關(guān)評估。評估時除關(guān)注消毒策略的有效性外，還應(yīng)關(guān)注相容性相關(guān)的信息。因為潔凈區(qū)內(nèi)的表面由于與清潔劑、消毒劑、殺孢子劑頻繁接觸，可能會對表面材質(zhì)造成負面影響，例如：

1)金屬腐蝕，常見的是不銹鋼被含氯消毒劑腐蝕生銹；

2)化學(xué)反應(yīng)，常見的如過氧化氫、過氧乙酸、酸酚、堿酚等氧化性較強或酸堿值高的消毒劑對有色金屬等的作用；

3)硬化，主要是軟性的材料如vinyl, Plexiglas,, epoxy等，例如醇類消毒劑對有機玻璃的破壞；

4)變色/染色：例如酚類、含碘消毒劑會導(dǎo)致表面變色。

因此我們需要進行采取相關(guān)措施來避免以上情況的出現(xiàn)，常見措施有：

1)在選擇消毒劑時，要對其與潔凈區(qū)內(nèi)的表面材質(zhì)的相容性進行評估；

2)應(yīng)定期對表面的殘留進行有效的清潔，如使用專門的清潔劑等；

3)應(yīng)評估清潔劑與消毒劑、以及不同的消毒劑之間的相容性問題；

4)避免表面接觸過量的清潔劑/消毒劑，例如清潔消毒時用量過大等。

消毒劑評估后基本可以制定出適宜的清潔消毒程序。制定清潔消毒程序后我們需要結(jié)合消毒劑基本信息和消毒劑殺滅微生物的影響因素對清潔消毒程序進行簡單評估，特別注意一些低級錯誤，例如醇類揮發(fā)很快，其接觸時間應(yīng)不大于2分鐘。

清潔消毒程序制定時關(guān)于兩種消毒劑輪換，我們可以考慮使用一種消毒劑和低濃度殺孢子劑輪換，這樣可以更有效的降低微生物污染，不過我們需要注意殺孢子劑往往具有一定的腐蝕性，因此無法一直使用殺孢子劑。

3、消毒劑效力驗證

3.1消毒劑效力驗證準(zhǔn)備工作

明確清潔消毒程序后便是消毒劑效力驗證，驗證開始前我們需要準(zhǔn)備相關(guān)的載體和試驗菌。

消毒劑效力驗證主要分懸液法和載體法。懸液法用于對消毒劑種類、濃度等進行快速初篩。雖說對于一些具體應(yīng)用如儲罐、管道、生物反應(yīng)器的浸泡消毒也比較適用。但是，不能以懸液法的考察結(jié)果來代替載體法的考察，即載體法是比懸液法更有必要性。

懸液法準(zhǔn)備同微生物計數(shù)法方法適用性類似。而對于載體法還需要收集潔凈區(qū)需清潔消毒的各類待消毒表面的材質(zhì)信息等（考慮常見類型和不便于清潔消毒的類型，關(guān)于材質(zhì)選擇等部分不展開）。測試用的載體不應(yīng)過大（不超過38mm×38mm）以避免操作過程出現(xiàn)假陽性。

測試用的試驗菌需要涵蓋細菌、酵母菌、霉菌，最好有來源于廠房的環(huán)境菌。如果環(huán)境菌暫時沒有的，我們可以選擇標(biāo)準(zhǔn)菌代替，待環(huán)境菌收集到后再行補充。根據(jù)消毒劑的類型選擇適合的微生物進行考察。對于環(huán)境菌的選擇需要注意被選擇的環(huán)境菌除具有代表性或耐藥性或難殺滅等特點外，還有注意其是可培養(yǎng)可計數(shù)的，如極容易蔓延或這生長緩慢導(dǎo)致無法計數(shù)的試驗菌可以不做選擇。

3.2中和劑效力驗證

中和劑效力驗證主要是中和劑的有效性和無毒性兩點，中和劑的有效性是中和消毒劑后加菌，中和劑的無毒性類似于原輔料的方法適用性試驗。

以前中和劑效力驗證的難點在于如何選擇合適的中和劑，如醇類使用吐溫80效果并不好，而應(yīng)使用組合配方如D/E中和肉湯（細節(jié)見下圖）或其他配方（吐溫80 30g/L，皂苷30g/L，組氨酸1.0g/L，半胱氨酸1.0g/L）。

除使用中和劑外也可通過薄膜過濾的方式消除消毒劑殘留。

3.3消毒劑效力評估-懸液法

3.3.1懸液法的實驗步驟

供試品接種 每 1ml 消毒劑接種不少于 105cfu 的試驗菌。

存活菌數(shù)測定 在達到設(shè)定除菌作用時間后采用適宜的方法（如加入經(jīng)驗證的中和劑或薄膜過濾）消除消毒劑的抑菌作用，照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法（通則 1105）”分別測定接種微生物和消毒處理后的供試品中所含菌數(shù)，測定細菌用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，測定真菌用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

根據(jù)存活菌數(shù)測定結(jié)果計算每1ml供試品中各試驗菌的含菌數(shù)，并換算成lg值。

3.3.2懸液法的其他考量

懸液法除用于對消毒劑種類、濃度等進行快速初篩外，也可進行除菌作用時間的初步研究。

其次無論時懸液法還是載體法，菌懸液的制備非常關(guān)鍵。相對于液體培養(yǎng)物離心后收集菌體，個人更傾向于瓊脂培養(yǎng)物洗脫制備菌液， 瓊脂培養(yǎng)物更好得到 高濃度的菌液（注意菌液混勻時加入無菌的玻珠，這樣分散更容易均勻）。不同于微生物方法適用性的菌液為新鮮培養(yǎng)物即可，為保證試驗菌活性復(fù)蘇后傳代將更適宜。

為保證實驗的一次成功率，計數(shù)時需要注意選擇2~3個稀釋級進行計數(shù)，載體法也需同樣操作。

3.4消毒劑效力評估-載體法

3.4.1載體法的實驗步驟

載體的準(zhǔn)備：試驗用載體應(yīng)預(yù)先清潔處理。

供試品接種 在載體表面接種試驗菌，菌液應(yīng)在載體表面涂勻。干燥后使得每個載體染菌量不少于 105cfu，滴加消毒劑覆蓋染菌區(qū)。部分試驗菌尤其是革蘭氏陰性菌在制備成染菌載體過程中會死亡，可適當(dāng)提高接菌量。

存活菌數(shù)測定 在達到設(shè)定除菌作用時間后，采用振搖法、擦拭法等方法收集載體上的試驗菌，收集液采用適宜的方法（如加入經(jīng)驗證的中和劑或薄膜過濾）消除消毒劑的抑菌作用，照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法（通則1105）”分別測定接種微生物和消毒處理后的供試品中所含菌數(shù)，測定細菌用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，測定真菌用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。根據(jù)存活菌數(shù)測定結(jié)果計算每 1ml 供試品中各試驗菌的含菌數(shù)，并換算成 lg 值。

3.4.2載體法的實驗細節(jié)

1)關(guān)于載體如何進行清潔處理，征求意見稿中并未做明確說明。個人理解主要是降低生物負載和表面潔凈（減少表面的阻礙物顆粒和可能影響消毒劑的化學(xué)殘留等），對于耐堿材質(zhì)載體可以參考WS/T 798《消毒劑消毒效果定性試驗標(biāo)準(zhǔn) 應(yīng)用稀釋法》的5.1.2執(zhí)行。

2)載體清潔時也應(yīng)考慮滅菌對載體的影響，特別是干熱滅菌對于金屬材質(zhì)載體的影響等。

3)需要注意消毒劑的加入方式為滴加，與我們?nèi)粘＠斫獾哪M實際存在差異，因為研究噴霧法的重現(xiàn)性差。因此消毒劑效力評估時不能只局限于實驗結(jié)果，還需結(jié)合清潔消毒策略等進行評估。

4)對于干燥后使得每個載體染菌量不少于105cfu，注意是干燥后無論是自然干燥還是強制干燥，達到目的即可，不過需要注意對試驗菌活性的影響。

5)說到干燥，理論上溫度升高會加速揮發(fā)，但消毒劑在室溫下使用故驗證溫度通常為常溫。除非消毒表面要求高溫或低溫時消毒，可以在該溫度下進行效力測試。

6)對于“部分試驗菌尤其是革蘭氏陰性菌在制備成染菌載體過程中會死亡，可適當(dāng)提高接菌量”這點，應(yīng)注意控制液滴大小以縮短干燥時間（提高菌液濃度），避免菌體損傷。單純的增加液滴也可以實現(xiàn)提高接種量的目的，同時也會延長干燥時間，故需要注意。

7)對于載體材質(zhì)選擇，除參考表4外，應(yīng)注意304不銹鋼和316不銹鋼是存在差異的。對于一些擦拭布會存在存在易脫落纖維、消毒后易形變的現(xiàn)象，因此在選擇擦拭布時也應(yīng)考慮這些問題。

8)對于載體法需要特別注意避免交叉污染的問題，特別是滴加菌液后可能會產(chǎn)生氣溶膠。

9)進行載體法時可以進行多個除菌作用時間的研究用于支持日常清潔消毒接觸時間的制定。

4、消毒劑殘留驗證

首先消毒劑殘留需要注意是否接觸產(chǎn)品，如不接觸產(chǎn)品的地面是允許有少量殘留的。日常環(huán)境中消毒劑殘留更傾向與理化檢驗，本人不精通此處不展開。個人的策略是盡可能選擇無殘留的消毒劑。對于有殘留的消毒劑（如季銨鹽、苯酚等）可以通過使用專門的測試試劑條等來實現(xiàn)殘留測試的目的。

如果一定要進行消毒劑殘留測試，建議不是單次清潔后直接測試消毒劑殘留證明無殘留，而是周期性進行殘留檢測（日積月累見成效）。

其次對于驗證過程中的消毒劑殘留，通過中和劑有效性實驗結(jié)果即可判斷是否存在消毒劑殘留。

5、消毒劑存放效期及現(xiàn)場考察

5.1消毒劑存放有效期

對于消毒劑效期驗證，對于醇類可以通過其有效成分含量測定來說明問題，而對于復(fù)合消毒液等則較難測試。除含量測定外也可以通過效期末進行消毒劑效力測試來驗證有效期。

效期確認(rèn)時還需考慮進行消毒劑及其容器生物負載的研究（使用結(jié)束時能夠容器中進行取樣）。特別是無菌消毒劑使用期間的無菌性需要特別關(guān)注。

5.2現(xiàn)場考察

嚴(yán)格來說現(xiàn)場考察并不完全與消毒劑有關(guān)，是一個綜合評價的過程?，F(xiàn)場考察用以評估消毒劑對相應(yīng)設(shè)施的實際消毒能力，此類試驗通過監(jiān)測清潔消毒前后的環(huán)境微生物學(xué)質(zhì)量，和經(jīng)歷一段時間的數(shù)據(jù)積累后評估清潔消毒程序執(zhí)行的有效性。一個良好的清潔消毒方案應(yīng)該能明顯降低懸浮粒子數(shù)與微生物數(shù)量，同時不應(yīng)出現(xiàn)芽孢、霉菌?，F(xiàn)場考察要點如下：

1)非生物粒子 (總懸浮粒子數(shù)據(jù))

2)表面微生物、空氣微生物數(shù)據(jù)

3)人員微生物監(jiān)控數(shù)據(jù)

4)環(huán)境菌的分離與鑒定

5)表面消毒劑殘留的檢測

6)消毒劑質(zhì)量 (使用過程中的生物負載與無菌性)。

最后強調(diào)一下，我們的清潔和消毒方案中清潔是非常重要的環(huán)節(jié)。通過清潔可以使得后續(xù)的消毒更徹底，因為清潔能去除表面一部分微生物，降低微生物負載，同時減少表面上阻礙消毒劑的顆粒物和表面上可能影響消毒劑的化學(xué)殘留 (如藥品殘留、其他消毒劑殘留等)，對于有殘留消毒劑也可通過清潔減少本次消毒后的消毒劑殘留。

6、小結(jié)

如其說我們評價消毒劑，其實更多的是評價我們的整個清潔和消毒策略。正如《藥品微生物實驗室消毒劑效力評估指導(dǎo)原則草案公示稿》（第一次）結(jié)果判斷中強調(diào)：由于驗證試驗的菌株與實際環(huán)境中可能存在的低微量微生物的生長狀態(tài)、對消毒劑的耐受能力等不一致，消毒劑效力評估確定的除菌效果可能與實際應(yīng)用效果存在差異。對消毒劑效力評估結(jié)果的接受或應(yīng)用應(yīng)充分結(jié)合物理擦拭、清潔驗證、風(fēng)險管理需求等進行評估。

內(nèi)容來源：博普智庫作者-杋稞