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保乳手術的術中冷凍切片分析（frozen section analysis，F(xiàn)SA）對臨床意義重大，對病理醫(yī)師和病理技術員的要求較高。由于保乳手術乳腺切緣數(shù)量多，且脂肪組織不易冷凍，而前哨淋巴結(jié)周圍的脂肪組織難以剔除干凈以及存在內(nèi)部脂肪化等問題，給冷凍制片帶來一定的難度。因此，該共識是在大量臨床實踐的基礎上，總結(jié)出關于保乳標本乳腺切緣及前哨淋巴結(jié)冷凍制片的技術要點和切片方法，旨在為病理技術員提供更全面且有價值的技術指導及規(guī)范化操作，從而獲得高質(zhì)量的冷凍切片。隨著人們對早期乳腺癌生物學特點的深入研究，以及早期乳腺癌診斷技術的不斷改進和綜合治療技術的廣泛運用，使早期乳腺癌保乳手術的安全性和有效性不斷提高。保乳手術作為早期乳腺癌的外科治療手段之一，為患者提供個性化治療方案越來越受到重視。保乳手術已成為早期乳腺癌的標準治療方式[1]。保乳手術的切緣一直是乳腺外科和乳腺病理領域的重要話題[2]，因為保乳手術成功率的重點在于腫瘤是否被完整切除，即乳腺切緣應為陰性，切緣陽性對同側(cè)乳腺局部復發(fā)有顯著影響，也是決定患者二次手術率的重要因素[3-5]。目前可實施切緣評估的方法中，冷凍病理切片具有更好的時效性及可操作性，可在術中對切緣狀態(tài)進行評估，了解病變組織切除情況，分析手術是否成功[6]。各個機構都有其評估切緣的實際操作方法，一般情況下，保乳標本切除后，手術醫(yī)師用銀針或縫線按前、后、左、右、表面、基底立體方位做六點標記，然后涂染料送病理檢查，這要求保乳標本有多個切緣需要制片。前哨淋巴結(jié)的術中冷凍切片檢查是乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)有效且可靠的預測指標[7-8]。每一例保乳標本往往也有多顆前哨淋巴結(jié)需要制片。因此，保乳標本乳腺切緣及前哨淋巴結(jié)需要制片的數(shù)量多，且切緣多為脂肪組織，淋巴結(jié)周圍多帶有脂肪組織或存在內(nèi)部脂肪化等，不易冷凍，導致冷凍制片質(zhì)量參差不齊甚至難以制片。術中冷凍切片分析（frozen section analysis，F(xiàn)SA）對病理醫(yī)師和病理技術員的要求較高，需要經(jīng)過特殊訓練。為保證術中FSA的時效性，同時為病理技術員在較短時間內(nèi)完成多個切緣及淋巴結(jié)的制片并保證切片的完整性提供全面而有價值的技術細節(jié)指導，促進保乳標本乳腺切緣及前哨淋巴結(jié)冷凍制片的規(guī)范化操作，病理技術四大學組（中國醫(yī)師協(xié)會醫(yī)學技師委員會病理技術專家組、中國醫(yī)學裝備協(xié)會病理裝備分會標準化部、中國研究型醫(yī)院學會病理學專業(yè)委員會病理技術學組、中國抗癌協(xié)會腫瘤病理專業(yè)委員會病理技術學組）在大量臨床實踐的基礎上，聯(lián)合國內(nèi)相關領域的專家多次研討修正，制定本共識。 1.1 取材 臨床送檢的保乳標本必須保持新鮮、標記清晰，取材前不能使用氯化鈉注射液、固定液或其它液體浸泡組織；如果取材時標本用水沖洗，組織表面需用紙或紗布吸干；取材器械和取材臺面要保持潔凈，避免造成標本污染。取材病理醫(yī)師應根據(jù)臨床送檢保乳標本的實際情況及臨床要求，在條件允許范圍內(nèi)規(guī)范化取材，所取切緣組織不宜過大、過厚，亦不宜過小、過薄，較理想的組織長度和寬度為0.5-1.0 cm，厚度為0.2 - 0.3 cm。切緣組織過大、過厚的不良影響：（1）容易出現(xiàn)假陰性；（2）不利于快速冷凍；（3）不利于獲得完整、平整的切片。切緣組織過小、過薄的不良影響：（1）厚切時組織容易被切光，不利于完整制片；（2）容易出現(xiàn)假陰性。 1.2 切片溫度 （1）組織四周加適量包埋劑（包埋劑滴加在組織四周，少量、均勻分布即可，無需將組織完全埋在包埋劑中），浸入液氮快速冷凍。若所取切緣組織較小或較薄時，可根據(jù)組織大小先用少量包埋劑制作一個空白冰托，將組織放在冰托上，再如上進行包埋。（2）粗修至暴露所需的組織面并記住此時夾頭的方向。一般為所取組織的最大面，如果遇到離腫塊比較近的切緣需少修，若取材醫(yī)師有特殊要求可深修。（3）粗修后的組織再次浸入液氮中，冷凍到組織表面發(fā)硬（在液氮中冷凍3～4 s）。如冷凍時間過久，切片時組織和包埋劑將會成粉末狀難以完整切片；如冷凍時間不夠，切片時組織面仍呈軟濕狀態(tài)難以完整切片。1.2.2 使用冷凍輔助設備（以Milestone冷凍包埋儀為例）
（1）涂一點包埋劑在玻璃轉(zhuǎn)移板的尖端，組織需要切的一面朝下放在玻璃轉(zhuǎn)移板上，然后將組織移入冷凍模具里。（2）將模具用包埋劑填滿，冷凍頭平面朝下置于模具上。（3）加上取出器，蓋上蓋子，根據(jù)組織大小冷凍15～60ｓ。（1）提前設置冷凍切片機機箱溫度（CT）和冷凍頭溫度（OT）值，一般冷凍切片機可設置最低溫度約為－35℃。（2）組織四周加適量包埋劑（包埋劑滴加在組織四周，少量、均勻即可，無需將組織完全埋在包埋劑中），置于速凍臺上快速冷凍。若所取切緣組織較小或較薄時，可根據(jù)組織大小先用包埋劑制作一個空白冰托，然后將組織放在冰托上，再如上進行包埋。（3）待最外周包埋劑凝固時，用冷凍錘平行輕壓于組織塊上，若無冷凍錘可將組織塊倒扣于速凍臺上。 （4）粗修至暴露所需的組織面并記住此時夾頭的方向。一般為所取組織最大面，如遇到離腫塊比較近的切緣需少修，或取材醫(yī)師有特殊要求時可深修。 （5）將組織面朝下置于速凍臺上，充分冷凍到組織表面發(fā)硬。 1.3 切片厚度 切片厚度（15～30 μｍ），以能切出完整的切片為準。 1.4 切片速度 （1）無防卷板：保持夾頭方向與粗修時一致，快速單張切片，直到切出完整的切片（如果此時切片邊緣的包埋劑發(fā)生卷曲，可用毛筆輕輕攤開）。 （2）利用防卷板：保持防卷板及底座清潔，調(diào)整好刀片和防卷板的位置，使防卷板在刀鋒前約0.1ｍｍ并保持平行，使切片能平整地進入防卷板與切片刀之間的縫隙。保持夾頭方向與粗修時一致，將粗修后組織四周多余的包埋劑切除，快速單張切片，直到切出完整的切片。 1.5 貼片 提前準備好正確標號的玻片，在切出完整的切片后，快速貼片，防止脂肪組織軟化粘在板上而導致切片不能完整貼到玻片上。 1.6 固定及染色 貼片后需及時且充分固定（推薦在甲醇固定液中固定約1 min，固定液需每天更換以保證新鮮和足量），隨后放入全自動染色機按冷凍染色程序染色。如果是手工染色，在水洗和脫水等過程中需注意動作輕柔，避免因外力作用導致脂肪組織脫落，從而影響切片的完整性。所有染液需每天更換以保證濃度及足量，染色前先用試染切片試染，并根據(jù)染色結(jié)果調(diào)整染色時間。特別注意在季節(jié)交替等原因?qū)е颅h(huán)境溫度發(fā)生改變時，應做好切片染色的質(zhì)量控制。 （1）臨床送檢的前哨淋巴結(jié)組織必須保持新鮮，取材前不能使用氯化鈉注射液、固定液或其它液體浸泡組織，如取材時用水沖洗，組織表面需用紙或紗布吸干。取材器械和取材臺面要保持潔凈，避免造成標本污染。取材醫(yī)師用帶手套的手指觸摸找到較脂肪組織硬的淋巴結(jié)組織，盡可能完整剔除其表面的脂肪組織，可配合使用吸水紙或干凈紗布，輕輕擠壓去除表面的部分脂肪組織。（2）較厚的淋巴結(jié)沿最大面，按約2 ｍｍ的間隔剖開取材。（3）由于不同淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況存在差異，需要切片的深度可能不一樣，因此以一個冷凍頭放置一顆淋巴結(jié)為最佳。（4）若一個冷凍頭上需放置多顆淋巴結(jié)時，將大小及厚度相近的淋巴結(jié)并列放置于同一個冷凍頭，每個冷凍頭上最多不超過 3 顆淋巴結(jié)。如需將大小不等的淋巴結(jié)置于同一冷凍頭上，可先在放置較小者的一側(cè)底部墊一點包埋劑，使所放淋巴結(jié)保持在同一高度。（5）如遇需要關注是否有前哨淋巴結(jié)周圍組織侵犯時，取材需要保留一些附帶的脂肪組織，不可強行剔除。組織四周加適量包埋劑（包埋劑滴加在組織四周，少量、均勻即可，無需將組織完全埋在包埋劑中），浸入液氮或置于速凍臺快速冷凍，待四周包埋劑冷凍完成后使用冷凍錘輕壓在組織表面，可使組織和周圍的包埋劑更平整且冷凍更迅速，可有效減少冰晶的產(chǎn)生。如果沒有冷凍錘，可將冷凍頭組織面朝下倒置于冷凍臺上繼續(xù)冷凍。設置冷凍切片機機箱溫（CT）－20～－25℃，冷凍頭溫（OT）－15～－20℃。由于工作量不同，冷凍切片機機箱內(nèi)實際溫度與溫控溫度存在差異；冷凍切片機品牌不同、設計不同、性能不同，設定的溫度存在差異；同時組織大小不同適合的溫度也不同，因此需要根據(jù)實際情況將設定溫度略作調(diào)整。溫度過低易導致淋巴結(jié)組織發(fā)脆，組織切片在鏡下呈裂隙狀；溫度過高易導致淋巴結(jié)組織發(fā)軟，切片時組織皺縮，不易獲得平整無皺褶的切片。切片厚度5～6 μｍ為宜，切片過?。ǎ? μｍ）細胞不易著色，切片過厚（＞6 μｍ）易產(chǎn)生裂隙，且鏡下細胞重疊不利于診斷。2.5.1 周圍脂肪組織剔除干凈的實性淋巴結(jié) （1）選擇組織周圍包埋劑較多的位置朝下（作為最先切到位置），借助毛筆牽引切片。切片時注意用力要輕柔、均勻，避免因轉(zhuǎn)速不穩(wěn)導致切片厚薄不均或產(chǎn)生褶皺。（2）使用防卷板切片時，可將組織下緣以下的包埋劑全部切掉后再切片，可使組織直接進入防卷板與刀鋒的縫隙中，有效減少褶皺。2.5.2 “靠岸型”淋巴結(jié)（即淋巴結(jié)四周僅局部位置脂肪組織剔除干凈）（1）選擇淋巴結(jié)四周沒有脂肪組織的位置朝下（作為“錨定點”位置），再借助毛筆牽引切片。切片時注意用力要輕柔、均勻，避免因轉(zhuǎn)速不穩(wěn)導致切片厚薄不均或產(chǎn)生褶皺。（2）使用防卷板切片時，將組織下緣以下的包埋劑全部切掉，并盡可能將淋巴結(jié)周圍脂肪組織及包埋劑去掉后再切片，可使組織直接進入防卷板與刀鋒的縫隙中，有效減少褶皺（圖1）。
圖1 使用防卷板切淋巴結(jié)：A．粗修后淋巴結(jié)組織周圍仍有少量脂肪；B．將淋巴結(jié)組織下緣以下的包埋劑全部切掉，將淋巴結(jié)周圍脂肪及包埋劑盡可能去除后再切片 2.5.3 “孤島型”淋巴結(jié)（即淋巴結(jié)周圍脂肪組織均未剔除干凈） （1）二次包埋法更適合粗修后周圍脂肪組織較多而淋巴結(jié)組織較小且多顆時（圖２）：①組織周圍加適量包埋劑后冷凍，粗修至所需的組織切面。②將冷凍頭拿到冷凍切片機外復溫，待包埋劑稍變軟后，用尖頭鑷子將淋巴結(jié)輕輕取出放在吸水紙或干凈紗布上，仔細去掉周圍多余的脂肪組織，再將淋巴結(jié)重新放置于冷凍頭上進行第二次包埋。③借助毛筆或防卷板切片（切片方法參見周圍脂肪組織剔除干凈的實性淋巴結(jié)）。 （2）“搭橋”法更適合粗修后周圍脂肪較多且為單顆較小淋巴結(jié)時（圖３）：①組織周圍加適量包埋劑后冷凍，粗修至所需的組織切面。 ②將脂肪量較多的一端朝下作為“錨定點”，使用削尖的鉛筆頭輕輕插入該處脂肪中，將脂肪組織擠出后用紗布輕輕擦去，左右輕輕晃動鉛筆，使四周輕輕探出一個“口大底小”的口袋狀小凹槽，為后續(xù)的包埋劑填充留出適宜空間（注意鉛筆接近淋巴結(jié)邊緣時要由遠及近，即由邊緣脂肪組織向淋巴結(jié)組織方向劃動，越靠近淋巴結(jié)動作越輕柔，避免傷及淋巴結(jié)被膜）。 ③保持樣本夾頭固定在原位，將包埋劑擠入凹槽中，并在凹槽及其周圍反復涂抹幾次，確保有足量的包埋劑進入凹槽中。然后快速用冷凍錘輕壓，可進一步將凹槽中的包埋劑深入推進并快速冷凍成型。 ④輕輕修掉表面包埋劑，注意此時的修片動作不宜過快，進刀幅度不宜過大，邊修邊觀察，越接近目標切面越“輕、緩、穩(wěn)”。 ⑤修出所需的完整切面后，借助毛筆或防卷板切片。 
圖2 二次包埋法切淋巴結(jié)：A．粗修后淋巴結(jié)組織周圍脂肪較多且為多顆較小淋巴結(jié)；B．將冷凍頭復溫，包埋劑稍變軟后，用尖頭鑷子將淋巴結(jié)輕輕取出，去除其周圍多余的脂肪，將淋巴結(jié)重新包埋后再切片 圖3 “搭橋”法切淋巴結(jié)：A．粗修后淋巴結(jié)組織周圍脂肪較多且為單顆較小淋巴結(jié)；B．將脂肪量較多的一端朝下，使用鉛筆尖輕輕插入將脂肪組織擠出形成小凹槽，將足量包埋劑推入小凹槽作為“錨定點”，將淋巴結(jié)表面輕修平整后再切片 2.5.4 內(nèi)部脂肪化的淋巴結(jié) （1）內(nèi)部脂肪化但四周仍有較多實性組織的淋巴結(jié)：可參考“靠岸型”淋巴結(jié)操作。 （2）內(nèi)部脂肪化且四周均是脂肪組織的淋巴結(jié)：可參考“孤島型”淋巴結(jié)操作。 2.6 固定及染色
2.6.1 固定 由于淋巴結(jié)組織的冷凍切片中細胞豐富密集，淋巴細胞易收縮，細胞核染色較深，因此選擇合適的固定液（既能快速固定，又有良好的固定效果）對淋巴結(jié)冷凍切片的HE染色質(zhì)量有較大影響。貼片完成后應立即放入固定液中充分固定，切忌切片干燥后再固定，若不及時充分固定易造成細胞退變，細胞核模糊不清，組織原有結(jié)構喪失而影響診斷。在環(huán)境溫度高或空氣干燥的情況下，室溫越高，細胞退變速度越快[9]。推薦使用固定液： （1）甲醇，冷凍固定速度快，細胞收縮小，對細胞核和抗原的保存較好。 （2）AAF液（95％乙醇85 ｍＬ＋40％甲醛10ｍＬ＋冰醋酸5 ｍＬ），兼有１０％中性福爾馬林和95％乙醇的作用，冰醋酸能抵消乙醇引起的細胞收縮，對抗原保存較好。 2.6.2 染色 切片充分固定后，依次進行水洗（2～5ｓ）→ 蘇木精染色（1～4 ｍｉｎ）→水洗（10ｓ）→藍化（2ｓ）→水洗（30ｓ）→伊紅染色（2～10ｓ）→梯度乙醇（75％乙醇，2ｓ；85％乙醇5ｓ；95％乙醇5ｓ；100％乙醇Ⅰ 5ｓ；100％乙醇Ⅱ 5ｓ）脫水→二甲苯（二甲苯Ⅰ 5ｓ；二甲苯Ⅱ 10ｓ）透明→封固（各試劑的時間不同，實驗室可根據(jù)實際情況作適當調(diào)整）。所有染液需根據(jù)切片數(shù)量及時更換，以保證其濃度及足量，染色前須先用試染的切片進行試染，并根據(jù)試染結(jié)果調(diào)整染色時間。特別注意在季節(jié)交替、環(huán)境溫度發(fā)生改變時，需做好切片染色的質(zhì)量控制。 2.7 前哨淋巴結(jié)切片產(chǎn)生冰晶的補救措施 規(guī)范取材的前哨淋巴結(jié)，由于沒有及時快速冷凍，造成切片鏡下冰晶嚴重而影響診斷時，可通過重新快速冷凍的方法來改善：將已經(jīng)加包埋劑冷凍的組織放到室溫環(huán)境下復溫，直至包埋劑完全融化，淋巴結(jié)組織回到取材時的狀態(tài)（此時如果淋巴結(jié)周圍有可去除的脂肪可進一步將其剔除干凈），重新包埋后及時快速冷凍再切片，可改善部分細胞間的冰晶。 本共識詳細闡述組織取材、切片方法、切片技巧及注意事項等，從實際出發(fā)，力求簡捷、具有可操作性和指導性，為推進保乳標本乳腺切緣及前哨淋巴結(jié)冷凍制片的規(guī)范化、標準化程度奠定基礎。目前本共識仍有一定的局限性，需廣大病理技術工作者在實踐中不斷總結(jié)經(jīng)驗、拓展思路，探求更多、更好的方法。參與本版共識的病理技術專家成員（按單位名稱漢語拼音字母排序）：安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（潘美華）；北京大學醫(yī)學部病理學系／北京大學第三醫(yī)院（張燕）；北京大學腫瘤醫(yī)院（周立新）；重慶市人民醫(yī)院（劉瑾）；福建省立醫(yī)院（陳昕）；福建省腫瘤醫(yī)院（師怡、吳在增）；福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院（李國平）；復旦大學附屬華山醫(yī)院（高名士）；復旦大學附屬中山醫(yī)院（宿杰阿克蘇、黃潔）；復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院（蔡旭、張靜、周學科）；廣東省人民醫(yī)院（駱新蘭）；廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（黨裔武）；廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院（崔錦珠）；海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院（倪燦榮）；哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院（孟宏學）；航天中心醫(yī)院（侯芳）；河南省人民醫(yī)院（孫廷誼）；湖北省腫瘤醫(yī)院（王明偉）；華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院（羅丹菊、翁密霞）；江蘇省人民醫(yī)院（張煒明）；江南大學附屬中心醫(yī)院（湯鴻）；第一附屬醫(yī)院（胡沛臻、錢守斌）；遼寧省腫瘤醫(yī)院（何蓮）；陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院（毛成毅）；南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院（吳鴻雁、楊軍）；寧波臨床病理診斷中心（陳潔、俞吉霞）；寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院（秦瞡、李國富）；青島大學口腔醫(yī)學院（趙潔）；陜西省寶雞市中心醫(yī)院（徐燕）；陜西省腫瘤醫(yī)院（王曉敏）；上海交通大學附屬新華醫(yī)院（虞文偉）；上海交通大學附屬瑞金醫(yī)院（許海敏）；上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽醫(yī)院（冼志紅）；首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院（高穎）；四川大學華西醫(yī)院（雷松、陳敏）；蘇州大學附屬第一醫(yī)院（朱衛(wèi)東）；山西省腫瘤醫(yī)院（肖彥增）；天津中心婦產(chǎn)科醫(yī)院（宋劍嬋）；溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院（黃卡特）；西安交通大學第二附屬醫(yī)院（靳耀鋒）；新疆石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院（鄭玉琴）；新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（師藝、苗娜）；云南省腫瘤醫(yī)院（陳蕓）；云南省第三人民醫(yī)院（徐開軍）；浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院（王海軍）；浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院（丁偉、姚洪田、徐黎明、鄒尹影、楊如菊）；浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市第一人民醫(yī)院（王煒）；浙江省腫瘤醫(yī)院（胡錦林、張谷）；鄭州大學第一附屬醫(yī)院（高冬玲、黃培、王蕓姣）；中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心（宋欣）；中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院（馬恒輝、王璇）；中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院（秦海明）；中國人民解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學中心（康佳蕊）；中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院（王德田、薛曉偉、龐鈞譯）；中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院（!）；中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院（鄭波、郭蕾）；中南大學湘雅醫(yī)院（傅春燕、徐志杰）；中日友好醫(yī)院（張紅雷）；中山大學附屬第一醫(yī)院（梁英杰、董愉）；中山大學腫瘤防治中心（肖永波、盧佳斌）。丁 偉（E-mail：181010@zju.edu.cn）楊如菊（E-mail：yri0205074@163.com）
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