導(dǎo)讀：

阿爾茨海默?。ˋD）是最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，特征是細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積和細(xì)胞內(nèi)過(guò)度磷酸化的tau累積。先天性免疫通路的幾個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子是AD的遺傳危險(xiǎn)因素。這些遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素結(jié)合體內(nèi)研究揭示了小膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)鍵作用。不斷出現(xiàn)的新的證據(jù)也指出適應(yīng)性免疫反應(yīng)在AD發(fā)病機(jī)制中的重要作用。近期，《Immunity》期刊發(fā)表了題為“Emerging roles of innate and adaptive immunity in Alzheimer's disease”的綜述文章，作者總結(jié)了先天免疫和適應(yīng)性免疫之間的交互作用，以及在AD發(fā)病和疾病進(jìn)程中的作用。此外，作者還總結(jié)了腦實(shí)質(zhì)中免疫細(xì)胞的組成和生理功能，以及腦邊界結(jié)構(gòu)中形成動(dòng)態(tài)疾病相關(guān)免疫生態(tài)位的細(xì)胞組成和生理功能。認(rèn)為腦實(shí)質(zhì)和邊界結(jié)構(gòu)中的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)都可以作為治療AD癥狀前和癥狀期的重要靶點(diǎn)。

01

前 言

“免疫豁免”的概念源于幾個(gè)世紀(jì)前，人們觀察到體外移植的外來(lái)組織或腫瘤在腦實(shí)質(zhì)中可不受免疫抑制而存活，但在外周組織中不行。然而當(dāng)組織先移植到外周，然后再移植到大腦時(shí)，它就會(huì)被排斥。盡管穩(wěn)態(tài)腦實(shí)質(zhì)可能不是大多數(shù)免疫細(xì)胞所在的典型位置，但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）所處的周圍環(huán)境發(fā)生改變后，非常駐免疫細(xì)胞能夠遷移到腦實(shí)質(zhì)并在其中生存。中樞神經(jīng)系統(tǒng)由不同的隔室組成：包含實(shí)質(zhì)、脈絡(luò)膜叢和腦脊液（CSF）的蛛網(wǎng)膜下腔、腦膜和腦顱骨骨髓。享有免疫豁免特權(quán)的部位似乎是特定的，并具有區(qū)域性差異?，F(xiàn)在人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)于穩(wěn)態(tài)中均發(fā)揮重要作用。在穩(wěn)態(tài)的大腦中，小膠質(zhì)細(xì)胞一直監(jiān)視著腦實(shí)質(zhì)。適應(yīng)性免疫細(xì)胞和先天免疫細(xì)胞的水平都很低，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及其來(lái)源的巨噬細(xì)胞，它們可以進(jìn)入大腦（特別是腦脊膜）并在大腦發(fā)育和學(xué)習(xí)中發(fā)揮作用。最近的研究表明，適應(yīng)性和先天免疫細(xì)胞可以通過(guò)連接顱骨骨髓和硬腦膜的顱骨通道填充硬腦膜。因此，在穩(wěn)態(tài)條件下，免疫細(xì)胞可以進(jìn)入大腦的邊界區(qū)域，并與實(shí)質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞群形成潛在的連接。在穩(wěn)態(tài)條件下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大多數(shù)適應(yīng)性免疫細(xì)胞位于其邊界，這為檢測(cè)并響應(yīng)大腦和脊髓功能變化提供了可能性，同時(shí)通過(guò)免疫保護(hù)來(lái)維持神經(jīng)元功能（圖1 A）。

圖1：先天性免疫和適應(yīng)性免疫在穩(wěn)態(tài)和AD大腦中的相互作用

在疾病條件下，如神經(jīng)退行性疾病，先天性免疫和適應(yīng)性免疫都會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的變化。阿爾茨海默?。ˋD）是最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病。一個(gè)多世紀(jì)以前，1907年，Alois Alzheimer發(fā)表了一個(gè)51歲婦女的病例報(bào)告，她表現(xiàn)出失憶、混亂和定向障礙的癥狀。病理學(xué)上，AD的特征是局部腦萎縮，相應(yīng)的神經(jīng)元和突觸丟失，這可能導(dǎo)致認(rèn)知功能的變化。也有研究認(rèn)為AD是一種蛋白質(zhì)聚集障礙疾病，涉及兩種主要蛋白質(zhì)。淀粉樣蛋白β （Aβ）在細(xì)胞外累積成淀粉樣斑塊并在腦血管壁中積累，形成腦淀粉樣血管?。–AA）。微管相關(guān)蛋白tau主要聚集在神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)中，并以翻譯后修飾的形式出現(xiàn)，包括過(guò)度磷酸化和其它翻譯后修飾。Tau聚集物存在于Aβ斑塊周圍的營(yíng)養(yǎng)不良神經(jīng)突（NP Tau）、神經(jīng)泌絲（NTs）和神經(jīng)纖維纏結(jié)（NFTs）中。AD不僅僅是一種蛋白質(zhì)病，因?yàn)锳β和tau聚集導(dǎo)致突觸、神經(jīng)元和血腦屏障（BBB）的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞以及一些外周免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。因此，即使在不被認(rèn)為是自身免疫性疾病的情況下，免疫環(huán)境也可能發(fā)生變化，局部環(huán)境變化和免疫細(xì)胞從血液和邊界區(qū)域浸潤(rùn)都可能導(dǎo)致AD腦實(shí)質(zhì)內(nèi)先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的發(fā)生明顯變化（圖1B）。

在這篇綜述中，作者重點(diǎn)介紹AD病理特征隨AD進(jìn)程的變化，AD局部先天和適應(yīng)性免疫的研究進(jìn)展，免疫反應(yīng)在AD進(jìn)展中的可能作用，以及制定相應(yīng)治療策略的挑戰(zhàn)和機(jī)遇。

02

AD的病理發(fā)展與進(jìn)展

AD有一個(gè)漫長(zhǎng)的臨床前階段，隨后是臨床癥狀階段。Aβ沉積開(kāi)始于新皮層，并在疾病的臨床前（無(wú)癥狀）階段緩慢而穩(wěn)定地積累。這一過(guò)程開(kāi)始于臨床上可檢測(cè)到認(rèn)知障礙發(fā)生前約20年。癥狀出現(xiàn)的時(shí)間，通常以情景記憶障礙為特征，這時(shí)候Aβ沉積已經(jīng)非常多，接近其最大程度。Tau病理直到出現(xiàn)癥狀的前幾年才開(kāi)始在新皮層的特定區(qū)域積聚，其存在的位置與臨床可檢測(cè)到的認(rèn)知障礙以及腦萎縮的發(fā)生和進(jìn)展高度相關(guān)。目前通過(guò)使用血漿、CSF和神經(jīng)影像生物標(biāo)記物可以在活體人腦中檢測(cè)蛋白質(zhì)聚集的變化，這些生物標(biāo)記物在疾病分期、結(jié)果預(yù)測(cè)和評(píng)估不同治療方法方面具有重要價(jià)值。例如，當(dāng)?shù)矸蹣拥鞍组_(kāi)始沉積，腦脊液和血漿中可溶性單體Aβ42水平和Aβ42/40比值下降，隨后不同種類的p-tau和總tau增加，這些都標(biāo)志著淀粉樣蛋白沉積增加。隨著淀粉樣蛋白的廣泛積累，tau病理開(kāi)始進(jìn)入新皮層并擴(kuò)散，這些變化可通過(guò)淀粉樣蛋白和正電子發(fā)射斷層掃描（PET）進(jìn)行淀粉樣蛋白和tau成像來(lái)檢測(cè)。tau病理擴(kuò)散后，使用PBR28等化合物進(jìn)行PET掃描可以在體內(nèi)檢測(cè)到小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。作為淀粉樣斑塊的主要成分，Aβ是由淀粉樣前體蛋白（APP）在α或β-分泌酶（BACE1）和γ-分泌酶分別以非淀粉樣或淀粉樣模式連續(xù)分解產(chǎn)生。在內(nèi)體加工后，在突觸活動(dòng)調(diào)節(jié)的過(guò)程中，Aβ被分泌到組織液 （ISF）。在非病理?xiàng)l件下，Aβ主要以40個(gè)氨基酸的多肽（Aβ40）的形式存在，還有少量其它形式的Aβ肽，包括更長(zhǎng)、更具淀粉樣變性的形式，如Aβ42。在常染色體顯性AD中，Aβ聚集的早期發(fā)作是由多種因素驅(qū)動(dòng)的，取決于基因突變，包括（1）相對(duì)過(guò)量的Aβ42和較長(zhǎng)而非較短形式的Aβ異構(gòu)體，（2）所有形式的Aβ的過(guò)量產(chǎn)生，（3）Aβ序列的改變導(dǎo)致更容易聚集的形式出現(xiàn)。在晚發(fā)性AD（LOAD）中，大多數(shù)證據(jù)表明Aβ清除存在問(wèn)題。當(dāng)Aβ聚集確實(shí)存在時(shí)，較長(zhǎng)的形式容易形成更高階的低聚物、原纖維或纖維，如Aβ42，它們是不可溶性的并于腦實(shí)質(zhì)中開(kāi)始形成。一旦淀粉樣斑塊形成，反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞就會(huì)包圍纖維斑塊。這一過(guò)程與腫脹、扭曲的軸突和樹(shù)突（營(yíng)養(yǎng)不良的神經(jīng)突起）的形成有關(guān)。值得注意的是，Aβ肽不僅聚集在實(shí)質(zhì)細(xì)胞外斑塊中，而且以CAA的形式聚集在軟腦膜和穿透腦血管的壁上。CAA通常會(huì)導(dǎo)致血腦屏障破壞、血管調(diào)節(jié)失調(diào)、缺血，有時(shí)還會(huì)出血。

正如前文提及，是tau病理，而非Aβ的積累，與認(rèn)知障礙和區(qū)域性腦萎縮密切相關(guān)。Tau是一種微管結(jié)合蛋白，在正常情況下主要定位于神經(jīng)元的軸突。在AD中，tau以其它方式過(guò)度磷酸化和翻譯后修飾（如乙?；?、泛素化），并聚集成寡聚體和成對(duì)的螺旋細(xì)絲，構(gòu)成神經(jīng)元胞體中NP tau、NTs和NFTs的結(jié)構(gòu)。臨床-神經(jīng)病理相關(guān)性分析表明，tau病理在AD的整個(gè)大腦中傳播了好幾年，并以一種模式分布在神經(jīng)解剖學(xué)關(guān)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)中，構(gòu)成Braak分期的基礎(chǔ)。雖然可以看到幾種模式，但最常見(jiàn)的模式是tau病理首先出現(xiàn)在內(nèi)嗅皮層 （Braak I期和II期），這在大多數(shù)60歲以上人群中可見(jiàn)，不管他們是否患有AD。在認(rèn)知衰退開(kāi)始的前幾年，tau病理擴(kuò)展到下丘腦和下顳葉新皮質(zhì)的邊緣結(jié)構(gòu)（Braak III）。這些區(qū)域參與記憶功能形成和視覺(jué)物體識(shí)別等功能。隨著認(rèn)知能力的下降，tau病變出現(xiàn)在島葉和中顳葉皮質(zhì)，然后是涉及情緒處理和記憶的區(qū)域（Braak IV），最后出現(xiàn)在新皮質(zhì)的其他區(qū)域（Braak V和VI）。

除非伴有大量Aβ病理，否則幾乎看不到tau聚集體的朊病毒樣擴(kuò)散特征，這表明在疾病發(fā)展過(guò)程中Aβ和tau病理功能上相互作用。Aβ和tau之間的功能相互作用引出以下問(wèn)題：（1）Aβ的病理如何影響tau的病理和tau相關(guān)的神經(jīng)變性？（2）tau的病理是否會(huì)反過(guò)來(lái)對(duì)Aβ的病理產(chǎn)生影響？通過(guò)將人AD-tau注射到攜帶淀粉樣蛋白斑塊的轉(zhuǎn)基因小鼠的大腦中，含有Aβ斑塊的轉(zhuǎn)基因小鼠在一定時(shí)間內(nèi)成功地產(chǎn)生了三種類型的tau病理（NP tau、NTS和NFTs），這表明Aβ斑塊創(chuàng)造了一個(gè)獨(dú)特的環(huán)境，有助于tau種子的快速擴(kuò)散。重要的是，在這個(gè)模型系統(tǒng)中，小膠質(zhì)細(xì)胞在這一過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。Aβ斑塊是啟動(dòng)病理性tau傳播級(jí)聯(lián)的必要條件，但不是充分條件，因?yàn)檫€需要具有正確構(gòu)象的錯(cuò)誤折疊的tau種子。在表達(dá)人Aβ和tau的小鼠中，tau依賴性神經(jīng)元活動(dòng)抑制主導(dǎo)Aβ依賴性神經(jīng)元過(guò)度活動(dòng)，這再次表明決定功能狀態(tài)的是Tau而不是Aβ。一個(gè)流行的假設(shè)是，存在一個(gè)Aβ依賴性疾病期，主要發(fā)生在疾病的癥狀前階段，這對(duì)于全面爆發(fā)是必要的，但不是充分的。確定癥狀出現(xiàn)的時(shí)間很重要。隨后會(huì)有一個(gè)更獨(dú)立于Aβ的時(shí)期，推動(dòng)疾病的發(fā)展。如果這一假設(shè)是正確的，那么如果在Aβ非依賴性疾病階段進(jìn)行抗Aβ治療的益處可能是有限的。考慮到這些事件的發(fā)生時(shí)間以及Aβ和tau之間的相互作用，在Aβ依賴病期之前或期間進(jìn)行針對(duì)Aβ的治療，并在Aβ非依賴病期針對(duì)tau或聯(lián)合治療，有望產(chǎn)生更好的效果。同時(shí)，闡明Aβ和Tau之間的潛在驅(qū)動(dòng)因素和功能相互作用，包括先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、自噬、蛋白酶體功能、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和線粒體功能的變化，可能有助于調(diào)節(jié)疾病進(jìn)展。

03

AD遺傳易感因素在先天性免疫和AD中的意義

罕見(jiàn)的常染色體顯性阿爾茨海默病是由3個(gè)基因中的一個(gè)突變引起的，即β-淀粉樣前體蛋白（APP）、早老素1（PSEN1）或早老素2（PSEN2）。這些病例的臨床發(fā)病年齡通常在30歲至60歲之間。LOAD在65歲以后發(fā)病，也受到遺傳因素的高度影響，遺傳學(xué)研究對(duì)于了解LOAD的潛在病因非常重要。全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）以及其它方法已經(jīng)確定了許多AD危險(xiǎn)因素；有趣的是，超過(guò)一半明顯涉及特定基因的風(fēng)險(xiǎn)基因在免疫細(xì)胞，特別是小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中顯著富集或唯一表達(dá)，包括APOE，髓系細(xì)胞觸發(fā)受體2（TREM2），ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體（ABCA）家族，補(bǔ)體，CD33，HLA家族，MEF2C和MS4A家族。在基礎(chǔ)條件下或在疾病相關(guān)背景下對(duì)動(dòng)物的這些遺傳變異進(jìn)行建模，揭示了免疫反應(yīng)不僅是AD病理的次要反應(yīng)，而且是疾病發(fā)展和進(jìn)展的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。阿爾茨海默病的遺傳危險(xiǎn)因素如何與先天免疫相聯(lián)系，以及它們?cè)诎柎暮Ｄ“l(fā)病機(jī)制中的作用將在以下幾節(jié)中討論。

ApoE是一種存在于脂蛋白顆粒中的載脂蛋白。根據(jù)其存在的脂蛋白類型（例如極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白），它可以通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將脂類和膽固醇輸送到靶細(xì)胞。當(dāng)處于高密度脂蛋白中時(shí)，它也參與脂類和膽固醇流出細(xì)胞的反向運(yùn)輸。ApoE在許多器官中都有表達(dá)，在肝臟和腦中表達(dá)最多。在腦內(nèi)，ApoE主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，而在疾病條件下，其在反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加。低密度脂蛋白受體（Ldlr）和脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（LRP1）是調(diào)節(jié)腦內(nèi)ApoE水平和其它效應(yīng)的主要代謝受體。就其在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞膽固醇和脂質(zhì)外排的作用而言，含有ApoE的高密度脂蛋白通過(guò)Abca1和Abcg1增加其脂化狀態(tài)來(lái)參與這一過(guò)程。

人類ApoE是一種由299個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，有三個(gè)變異體，即E2（cys112/cys158）、E3（cys112/arg158）和E4（arg112/arg158）。研究表明，ApoE是LOAD的最強(qiáng)遺傳易感因素。最近研究表明，擁有兩個(gè)ApoE3 Christchurch （R136S）突變副本的個(gè)體具有抵抗常染色體顯性AD導(dǎo)致的認(rèn)知能力下降的作用。這種效應(yīng)背后的機(jī)制尚不清楚。然而，該個(gè)體有大量的淀粉樣變性和較少的tau病變，且有不同于其他病例的空間定位，表明這種ApoE突變體作用于Aβ和tau之間的界面，可能是通過(guò)影響先天性免疫反應(yīng)起作用。在另一種情況下，ApoE3變異體（V236E）似乎通過(guò)減少ApoE4聚集和增加膽固醇外流而減少Aβ病理。與ε3等位基因相比，ε4等位基因增加疾病風(fēng)險(xiǎn)，而ε2等位基因以劑量依賴的方式降低疾病風(fēng)險(xiǎn)。ApoE4攜帶者淀粉樣蛋白沉積更多，發(fā)病更早，一旦出現(xiàn)癥狀，癥狀進(jìn)展更快。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究證實(shí)ApoE4強(qiáng)烈影響Aβ沉積、tau介導(dǎo)的神經(jīng)變性和其它表型，如血腦屏障功能障礙、抗原遞呈和T細(xì)胞激活。就其在腦脂代謝中的作用而言，ApoE已被證明影響星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的脂代謝，這可能與其在AD病理中的一些作用有關(guān)。

ApoE是Aβ播散和斑塊形成所必需的。Aβ沉積小鼠與ApoE-/-小鼠雜交，幾乎不會(huì)形成纖維狀A(yù)β或CAA。在表達(dá)人ApoE3或ApoE4的APP/PS1-21小鼠中，出生后立即使用反義寡核苷酸（ASOS）降低ApoE水平可使Aβ播種和沉積顯著減少，且4月齡時(shí)Aβ的病理變化減少。相反，在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠出生時(shí)就過(guò)表達(dá)ApoE4會(huì)增加Aβ播種和病理。ApoE對(duì)Aβ播種和斑塊形成的影響似乎大都來(lái)自星形膠質(zhì)細(xì)胞。在5xFAD小鼠模型中，通過(guò)Csf1r-Cre/ApoE f/f選擇性敲除小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中的ApoE4對(duì)Aβ沉積沒(méi)有顯著影響；然而，通過(guò)在APOEf/f小鼠中使用小膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子表達(dá)Cre，選擇性地將人ApoE亞型從小膠質(zhì)細(xì)胞中移除，以及這種操作對(duì)Aβ相關(guān)病理的影響仍有待評(píng)估。有趣的是，在有Aβ沉積的小鼠（如APP/PS1-21和APP/PS1△E9小鼠）中敲除內(nèi)源性ApoE，導(dǎo)致Aβ纖維顯著減少，非纖維Aβ沉積增加。在少數(shù)確實(shí)形成了纖維斑塊的ApoE-/-小鼠腦內(nèi)，可觀察到斑塊相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞減少和更嚴(yán)重的神經(jīng)炎性營(yíng)養(yǎng)不良，表明ApoE在介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化、Aβ斑塊以及Aβ誘導(dǎo)的局部神經(jīng)突損傷方面發(fā)揮了重要作用。另一方面，在星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上，ApoE競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Aβ受體，如Ldlr和LRP1，因此削弱了抗體的清除。ApoE亞型的不同是否會(huì)影響淋巴和腦膜淋巴管對(duì)Aβ的清除尚不清楚，還需要進(jìn)一步研究。

在tau介導(dǎo)的神經(jīng)退行性變中，ApoE也發(fā)揮重要作用，并且不同ApoE亞型表現(xiàn)出不同的作用。據(jù)報(bào)道，在散發(fā)性tau蛋白病中，攜帶ApoE4等位基因的個(gè)體表現(xiàn)出更多的神經(jīng)變性。P301S tau轉(zhuǎn)基因小鼠與人ApoE基因敲除小鼠雜交，與ApoE2或ApoE3相比在ApoE4存在下，觀察到更多的tau病理和腦萎縮以及更明顯的反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。此外，P301S小鼠內(nèi)源性ApoE-/-或選擇性敲除星形膠質(zhì)細(xì)胞ApoE4會(huì)導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)性減弱、疾病相關(guān)基因表達(dá)變化和區(qū)域性腦萎縮。將ApoE4從小膠質(zhì)細(xì)胞中選擇性敲除是否會(huì)影響tau的病理或tau介導(dǎo)的神經(jīng)變性仍有待研究。

Trem2 是免疫球蛋白受體超家族的成員，表達(dá)于破骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，其在吞噬、代謝和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。磷脂、脂蛋白包括ApoE、Aβ寡聚體和凋亡神經(jīng)元在內(nèi)的脂蛋白均被報(bào)道為Trem2 潛在的配體。人類的Trem2 R47H突變，明顯增加AD風(fēng)險(xiǎn)，可能與Trem2 功能降低有關(guān)。配體與受體胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，TREM2跨膜結(jié)構(gòu)域與酪氨酸激酶結(jié)合蛋白（DAP12）和造血細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子（DAP10），它們依次招募酪氨酸蛋白激酶（SYK）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）進(jìn)行下游信號(hào)傳導(dǎo)。TREM2-DAP12/DAP10信號(hào)的下游通路包括細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)員、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活和mTOR信號(hào)傳導(dǎo)?？扇苄訲REM2（sTREM2）是TREM2的胞外結(jié)構(gòu)域被ADAM10/17（一種含有去整合素和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的蛋白）切割而脫落釋放出來(lái)。sTREM2作為AD患者小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥和神經(jīng)元損傷的腦脊液生物標(biāo)志物，促進(jìn)了TREM2臨床前研究成果的轉(zhuǎn)化。對(duì)于AD患者，sTREM2的增加與記憶力下降和海馬萎縮有關(guān)。sTREM2與腦脊液tau、p-tau呈正相關(guān)，并與R47H等基因變異攜帶者有關(guān)。sTREM2促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞存活并觸發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子反應(yīng)。

與ApoE類似，TREM2在淀粉樣斑塊形成和tau介導(dǎo)的腦萎縮的背景下，對(duì)疾病相關(guān)性小膠質(zhì)細(xì)胞（DAM）和疾病進(jìn)展顯示出潛在的雙重作用。在5xFAD小鼠中，TREM2-/-或者與AD風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)的TREM2 R47H突變導(dǎo)致斑塊相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞減少和周圍營(yíng)養(yǎng)不良軸突增加。斑塊相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞在TREM2功能降低或TREM2-/-還被證明顯著加劇了Aβ相關(guān)tau在淀粉樣蛋白模型中的播種和擴(kuò)散。由于TREM2功能下降與Aβ相關(guān)的局部毒性增加以及Aβ相關(guān)的tau在大腦中的播散有關(guān)，部分公司已經(jīng)開(kāi)發(fā)出治療方法，包括激活TREM2的抗體，這些抗體已經(jīng)進(jìn)入AD的臨床試驗(yàn)。在淀粉樣蛋白沉積的小鼠中，3月齡的TREM2-/-小鼠纖維狀A(yù)β的沉積顯著提高，而后在衰老過(guò)程中纖維Aβ以較低的速率沉積，這表明TREM2在早期階段限制淀粉樣蛋白沉積，而且在疾病進(jìn)展期間依賴年齡的局部微環(huán)境可能會(huì)將TREM2從有益轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生更不利的影響。與TREM2在Aβ模型中的作用相比，在tau病理小鼠模型（P301S小鼠）中，TREM2-/-或者TREM2 R47H突變減弱了小膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)并防止了腦萎縮。這表明TREM2的激活在Aβ病理的背景下發(fā)揮有益作用，但當(dāng)發(fā)生更嚴(yán)重的神經(jīng)退變時(shí)，它的激活可能是有害的。需要在這一領(lǐng)域進(jìn)行進(jìn)一步研究以更好地了解TREM2激活在調(diào)節(jié)AD小膠質(zhì)細(xì)胞功能中的作用，無(wú)論是急性還是慢性的，以及這些發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化意義。

小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中合成和分泌大部分補(bǔ)體蛋白并表達(dá)其受體的細(xì)胞。在衰老和AD的背景下，補(bǔ)體途徑及其清除功能增強(qiáng)。在Aβ沉積小鼠模型J20中，經(jīng)典補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的啟動(dòng)蛋白C1q在明顯的斑塊沉積之前增加并與突觸相關(guān)，可能導(dǎo)致突觸丟失。抑制APP/PS1DE9小鼠中的C1q、C3或小膠質(zhì)細(xì)胞補(bǔ)體受體CR3，可減少吞噬小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量以及早期突觸丟失的程度。在tau病模型中，C3ar1-/-使得P301S tau小鼠神經(jīng)炎癥、突觸缺陷、tau病理以及神經(jīng)變性的減輕。C5 siRNA治療減少了APP/PS1-21小鼠中Aβ相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞積聚。除了與突觸結(jié)合外，C1q還直接與Aβ和ApoE結(jié)合。在AD患者和APP/PS1-21小鼠的脈絡(luò)叢和Aβ斑塊中也觀察到了C1q-ApoE復(fù)合體。這些結(jié)果表明，補(bǔ)體通路的異常激活也是Aβ和tau介導(dǎo)的神經(jīng)變性的標(biāo)志和驅(qū)動(dòng)力，因此減弱過(guò)度激活的補(bǔ)體通路的是限制AD神經(jīng)變性相關(guān)病理的潛在治療靶點(diǎn)。

04

阿爾茨海默病先天免疫中的關(guān)鍵免疫信號(hào)通路

大量研究強(qiáng)調(diào)了ApoE、TREM2和補(bǔ)體途徑在AD病理發(fā)生發(fā)展中的重要性。越來(lái)越多的證據(jù)表明，免疫信號(hào)通路在AD相關(guān)的免疫細(xì)胞變化中也很重要，并在AD的病理過(guò)程中發(fā)揮著潛在的重要作用。NF-kB是一種已知的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)許多與神經(jīng)炎癥、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖和腦內(nèi)細(xì)胞凋亡相關(guān)的靶基因。NF-kB在Aβ肽處理后的原代神經(jīng)元和AD患者腦中早期斑塊周圍的神經(jīng)元中被激活。Tau病理還激活了小膠質(zhì)細(xì)胞中的NF-kB信號(hào)。在P301S tau轉(zhuǎn)基因小鼠中，NF-kB的失活部分恢復(fù)了小膠質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡，逆轉(zhuǎn)了tau介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄變化，并挽救了空間學(xué)習(xí)和記憶缺陷，表明過(guò)度活躍的NF-kB信號(hào)在tau介導(dǎo)的腦損傷中是有害的。

NOD、LRR和NLRP3主要在巨噬細(xì)胞和激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）和caspase-1前體形成NLRP3炎癥體，引發(fā)促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的產(chǎn)生。在APP/PS1△E9 Aβ沉積小鼠中，NLRP3-/-或Caspase-1-/-會(huì)顯著減少 Aβ斑塊的形成，增加小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的 Aβ吞噬作用，并改善空間記憶。NLRP3炎癥小體在原發(fā)性tau病患者和tau病理小鼠中也被激活。NLRP3-/-或Caspase-1-/-減少tau蛋白在Tau22小鼠中的過(guò)度磷酸化和聚集以及Aβ誘導(dǎo)的tau病理，表明小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥可能是觸發(fā)Aβ病理下游的tau病理的因素之一。

mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞能量代謝、生物合成、降解和自噬。mTOR在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中廣泛表達(dá)，并與其它幾種蛋白質(zhì)相互作用形成兩個(gè)不同的復(fù)合體，即mTORC1和mTORC2。mTOR活性受到嚴(yán)格調(diào)控且在腦中維持基礎(chǔ)自噬水平。在5xFAD淀粉樣蛋白沉積的TREM2-/-小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞中，觀察到mTOR激活和小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡受損，與代謝應(yīng)激反應(yīng)中的低能狀態(tài)和代償性自噬增強(qiáng)有關(guān)，這表明TREM2作為一種先天免疫受體，通過(guò)mTOR途徑影響AD病理中的小膠質(zhì)細(xì)胞代謝。環(huán)肌酸的加入增加了小膠質(zhì)細(xì)胞mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞活力，挽救了能量旺盛的小膠質(zhì)細(xì)胞代謝，并在Trem2-/-的5xFAD小鼠中對(duì)Aβ相關(guān)的神經(jīng)突營(yíng)養(yǎng)不良提供保護(hù)性作用，提示mTOR介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞代謝可能是一種獨(dú)特的治療方法。

TAM信號(hào)是由Tyro3、Ax1和Mer酪氨酸激酶受體的配體Gas6和蛋白質(zhì)S激活驅(qū)動(dòng)的。AXL和Mer表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，為其吞噬功能所必需。Axl和Mer在APP/PS1△E9小鼠的淀粉樣斑塊相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)甚至更顯著。TAM-/-小鼠出現(xiàn)較少的致密核心斑塊和較高的CAA，這表明TAM缺陷的小膠質(zhì)細(xì)胞Aβ吞噬功能受損，并影響實(shí)質(zhì)斑塊和CAA的形成。

干擾素（IFN）是廣泛表達(dá)的細(xì)胞因子，具有經(jīng)典的抗病毒和免疫監(jiān)視作用。干擾素家族包括兩個(gè)主要類別，干擾素-I和干擾素-Ⅱ（IFN-γ）。干擾素-I與干擾素-α/β受體（IFNAR）、IFNAR1和IFNAR2結(jié)合，激活Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK-STAT）信號(hào)通路，啟動(dòng)一大組干擾素刺激基因（ISG）的轉(zhuǎn)錄，包括ISG15、Ifitm1/2/3、IRF1/7和Mx1。在淀粉樣蛋白沉積的AD模型中，激活I(lǐng)SG的小膠質(zhì)細(xì)胞以一種年齡依賴的方式特異性地包圍含有核酸的Aβ斑塊。阻斷IFNARs有效減少5xFAD小鼠中STAT1+、CD68+和Clelc7a+小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和突觸丟失。小膠質(zhì)細(xì)胞特異性的IFNAR1缺失減輕了5xFAD小鼠的認(rèn)知缺陷。最近的研究還顯示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)性T細(xì)胞，特別是輔助性T細(xì)胞（Th1）表達(dá)IFN-γ，通過(guò)中和Aβ阻斷IFN-γ信號(hào)，可減少CD11b的表達(dá)和APP/PS1小鼠的斑塊負(fù)荷。值得注意的是，先天免疫受體和AD相關(guān)的觸發(fā)因素，如淀粉樣蛋白，以及AD中干擾素的產(chǎn)生是如何協(xié)調(diào)的，仍有待確定。由于tau的積聚和tau介導(dǎo)的神經(jīng)變性與AD和原發(fā)性tau病的認(rèn)知和功能下降密切相關(guān)，因此需要進(jìn)一步研究來(lái)解決以下核心問(wèn)題：在tau病理的背景下，干擾素信號(hào)是否會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)炎癥和神經(jīng)變性。

05

大腦中的免疫系統(tǒng)和免疫反應(yīng)

脊椎動(dòng)物的免疫防御由兩個(gè)子系統(tǒng)組成：先天免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)。先天免疫系統(tǒng)通過(guò)生殖細(xì)胞編碼的受體對(duì)病原體作出反應(yīng)，這些受體在非克隆分布的細(xì)胞類型中特別表達(dá)。在先天免疫反應(yīng)中，模式識(shí)別受體，如Toll樣受體（TLRs），識(shí)別微生物病原體和與損傷相關(guān)的分子模式（錯(cuò)誤折疊/聚集的蛋白質(zhì)、變性DNA和脂多糖[LPS]），并且對(duì)于觸發(fā)NF-kB信號(hào)和炎癥是必不可少的。先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞成分包括樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞（也包括腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞）和自然殺傷T細(xì)胞。先天免疫對(duì)觸發(fā)因素反應(yīng)迅速，但其反應(yīng)相對(duì)非特異性。相比之下，適應(yīng)性免疫反應(yīng)可以是特異的。其特異性取決于T細(xì)胞和B細(xì)胞上的大量抗原受體（TCR和BCR），這是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞成分。TCR和BCR的多樣性是通過(guò)位點(diǎn)特異性的DNA重組產(chǎn)生的，每個(gè)特定特異性的受體都以克隆的方式表達(dá)。這些受體共同組成了一個(gè)識(shí)別庫(kù)，增加了適應(yīng)性免疫反應(yīng)檢測(cè)一生中遇到的許多可能抗原的可能性。因此，先天免疫和獲得性免疫的性質(zhì)構(gòu)成了這兩種免疫類型之間的關(guān)鍵區(qū)別。

與免疫系統(tǒng)的兩個(gè)細(xì)胞組成臂一致，免疫反應(yīng)分為傳入臂和傳出臂。獲得性免疫反應(yīng)的傳入臂涉及將抗原呈遞給初始T細(xì)胞，導(dǎo)致它們的啟動(dòng)和激活。來(lái)自大腦的可溶性抗原和攜帶抗原的免疫細(xì)胞被輸送到頸深淋巴結(jié)（DCLN），在那里這些抗原被抗原提呈細(xì)胞（APC）遞送給T細(xì)胞和B細(xì)胞。抗原特異的T細(xì)胞和B細(xì)胞被激活，并在運(yùn)輸回大腦后進(jìn)行克隆性擴(kuò)張。在疾病條件下，APC在發(fā)炎的大腦中積累。目前尚不清楚腦實(shí)質(zhì)中的內(nèi)源性或浸潤(rùn)性APC是否具有抗原提呈功能并導(dǎo)致適應(yīng)性免疫反應(yīng)。新的APC、T細(xì)胞和B細(xì)胞進(jìn)入大腦，以及駐留的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)局部疾病病理的局部反應(yīng)，導(dǎo)致腦實(shí)質(zhì)中不同于腦內(nèi)平衡狀態(tài)時(shí)的免疫狀態(tài)的改變。當(dāng)抗原特異性T細(xì)胞到達(dá)腦實(shí)質(zhì)并發(fā)揮其效應(yīng)器功能時(shí)，適應(yīng)性免疫反應(yīng)的傳出開(kāi)始。然而，在此之前，這些細(xì)胞需要穿過(guò)血腦屏障或從腦邊界進(jìn)入實(shí)質(zhì)，在那里它們新遇到一個(gè)獨(dú)特的腦生態(tài)位，包括神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和腦液。免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)都會(huì)持續(xù)監(jiān)測(cè)環(huán)境，并根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，以維持體內(nèi)平衡。

06

阿爾茨海默病中大腦免疫生態(tài)位的保護(hù)及其失調(diào)

先天免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)都存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在動(dòng)態(tài)平衡的腦實(shí)質(zhì)中，盡管免疫生態(tài)位因免疫豁免而受到保護(hù)。在包括阿爾茨海默病在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病中，已經(jīng)出現(xiàn)了大量關(guān)于先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)參與疾病發(fā)生或發(fā)展的數(shù)據(jù)，表明腦實(shí)質(zhì)內(nèi)免疫狀態(tài)和免疫雙臂的重塑。在這里，作者回顧了最近關(guān)于保護(hù)免疫生態(tài)位的更廣泛結(jié)構(gòu)及其變化的研究，這些結(jié)構(gòu)可能在人類和模型系統(tǒng)的AD發(fā)展和進(jìn)展過(guò)程中改變先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)（圖1A和1B），并為未來(lái)的研究提供前景。

血腦屏障由腦微血管內(nèi)連續(xù)的內(nèi)皮細(xì)胞屏障組成，該屏障具有封閉的細(xì)胞間接觸，并被周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞終足所覆蓋。腦毛細(xì)血管的獨(dú)特結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了高的跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻和低的細(xì)胞旁和跨細(xì)胞的滲透性，從而限制了血液攜帶的分子進(jìn)入大腦，除非它們?cè)趦?nèi)皮細(xì)胞中有專門的受體和轉(zhuǎn)運(yùn)體。神經(jīng)成像和病理學(xué)研究表明，在AD和其他神經(jīng)退行性疾病中，以及在AD病理模型中，BBB功能障礙。這些變化包括血腦屏障通透性增加、微出血、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)減少、P-糖蛋白-1外流功能受損、抗體跨血腦屏障清除減少以及白細(xì)胞浸潤(rùn)增加。組織學(xué)研究也揭示了顯著的病理變化：AD患者死后腦組織，體外從AD患者的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞獲得的人血腦屏障樣結(jié)構(gòu)，以及帶有AD病理的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的血腦屏障改變。這些病理改變包括血源性蛋白滲漏，周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞變性，以及外周細(xì)胞浸潤(rùn)。盡管已有關(guān)于AD臨床前期和臨床癥狀期BBB的動(dòng)態(tài)細(xì)胞和分子變化的研究，但關(guān)于BBB變化的區(qū)域特異性、其在區(qū)域免疫重塑以及AD進(jìn)展中的意義仍需更多的研究。這將對(duì)調(diào)節(jié)血腦屏障的潛在療法進(jìn)行評(píng)估，既可以在神經(jīng)變性期間恢復(fù)其功能，也可能開(kāi)發(fā)繞過(guò)血腦屏障輸送藥物的方法，例如最近實(shí)現(xiàn)的使用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合生物制品的方法。

腦膜是一個(gè)包裹大腦的三層結(jié)構(gòu)，包含兩個(gè)薄的內(nèi)層，軟腦膜和蛛網(wǎng)膜物質(zhì)（合稱軟腦膜），以及外部硬腦膜層。腦脊液由脈絡(luò)叢的特殊上皮細(xì)胞產(chǎn)生，在軟腦膜內(nèi)的蛛網(wǎng)膜下腔流動(dòng)。腦脊液可以從血管周圍空間流入大腦的ISF，這種流動(dòng)可以被星形膠質(zhì)細(xì)胞末端足部水通道蛋白-4 （AQP4）調(diào)節(jié)，即所謂的Glym Phatic系統(tǒng)。AQP4極化分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞的血管周圍末端足部，表達(dá)缺陷和定位錯(cuò)誤會(huì)導(dǎo)致Aβ清除量減少，這與AD有關(guān)。在未來(lái)的研究中，確定血管周圍巨噬細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞在CSF/ISF血流中包圍穿透血管的作用以及它們?cè)谏砗筒±頎顟B(tài)下與神經(jīng)元的相互作用將是有趣的。這種流動(dòng)在實(shí)質(zhì)內(nèi)細(xì)胞外分子的交換中可能很重要，如細(xì)胞因子、可溶性Aβ和ISF內(nèi)的抗原，可以通過(guò)硬膜淋巴管在離開(kāi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)之前重新進(jìn)入腦脊液。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄學(xué)研究已經(jīng)成功地描述了硬腦膜和硬腦膜竇內(nèi)的免疫群體，包括巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、固有淋巴樣細(xì)胞（ILCs）、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞。T細(xì)胞更可能來(lái)自血液，T細(xì)胞更可能來(lái)自血液，而B(niǎo)細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞似乎來(lái)自從頭骨到大腦通道的鄰近骨髓。腦脊液中的CNS來(lái)源的抗原聚集在硬腦膜竇周圍，被局部APC捕獲，并可被呈遞給巡游的T細(xì)胞。這種監(jiān)測(cè)是由形成竇間質(zhì)生態(tài)位的內(nèi)皮細(xì)胞和壁細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的。T細(xì)胞在該部位識(shí)別DC和巨噬細(xì)胞呈遞的抗原，促進(jìn)組織常駐表型和硬腦膜內(nèi)的效應(yīng)功能。

有趣的是，功能性淋巴管存在于硬腦膜內(nèi)，能夠?qū)?lái)自腦實(shí)質(zhì)的腦脊液和局部免疫細(xì)胞（如T細(xì)胞）的液體和細(xì)胞因子運(yùn)送到dCLN，從而允許腦源性抗原和外周T細(xì)胞之間的相互作用。硬腦膜淋巴系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、其交界區(qū)和外周如何溝通有了新的認(rèn)識(shí)，特別是在神經(jīng)免疫相互作用方面。這可能會(huì)為神經(jīng)退行性疾病中的神經(jīng)免疫參與者提供重要線索。除了為分子進(jìn)入和排出大腦提供了一條不受血腦屏障影響的途徑外，腦膜還提供了一個(gè)場(chǎng)所，在此處外周免疫細(xì)胞可以即刻，甚至在傳遞給dCLNs之前，對(duì)APC在局部遞呈給T細(xì)胞的可溶性抗原儲(chǔ)備進(jìn)行采樣。

在13到14個(gè)月齡的5xFAD Aβ沉積小鼠中觀察到腦膜淋巴功能障礙，伴隨著整個(gè)腦膜中Aβ沉積顯著增加。切除5xFAD小鼠的腦膜淋巴管會(huì)加重Aβ在腦和腦膜中的沉積、小膠質(zhì)細(xì)胞增多和神經(jīng)血管功能障礙，并影響抗Aβ免疫治療的結(jié)果。有趣的是，增強(qiáng)腦膜的淋巴功能與Aβ抗體免疫治療相結(jié)合，可改善Aβ從腦中的清除。在未來(lái)，解決腦膜淋巴內(nèi)皮細(xì)胞以及構(gòu)成人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中腦膜淋巴管的其他細(xì)胞如何同時(shí)受到AD相關(guān)病理的影響，以及靶向大腦淋巴系統(tǒng)是否也是影響神經(jīng)免疫相互作用以影響tau病和tau介導(dǎo)的神經(jīng)退行性疾病的有效方法，將是非常有趣的。

07

阿爾茨海默病患者腦實(shí)質(zhì)內(nèi)固有免疫生態(tài)位的重建

AD患者中觀察到包括血管炎癥、血腦屏障功能障礙和腦膜淋巴系統(tǒng)引流障礙在內(nèi)的保護(hù)措施的缺失。當(dāng)保障措施失調(diào)時(shí)，包括神經(jīng)遞質(zhì)、趨化因子和細(xì)胞因子、抗原、凋亡神經(jīng)元誘導(dǎo)的受體系統(tǒng)類別、脫髓鞘以及腦實(shí)質(zhì)中反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的梯度信號(hào)在內(nèi)的綜合信號(hào)成分可能導(dǎo)致白細(xì)胞浸潤(rùn)。這可能會(huì)導(dǎo)致腦實(shí)質(zhì)內(nèi)先天免疫和獲得性免疫的重大變化，而影響疾病的進(jìn)展。

小膠質(zhì)細(xì)胞是由卵黃囊紅髓樣前體產(chǎn)生并在胚胎發(fā)育過(guò)程中遷移到腦實(shí)質(zhì)的先天性免疫細(xì)胞。據(jù)報(bào)道，小膠質(zhì)細(xì)胞廣泛參與出生前后的腦發(fā)育和腦功能調(diào)節(jié)，即免疫監(jiān)視、重塑神經(jīng)元連接和功能、吞噬碎片和凋亡細(xì)胞以及脫髓鞘/髓鞘再生。AD和其他神經(jīng)退行性疾病患者的大腦中存在神經(jīng)炎癥，而小膠質(zhì)細(xì)胞是AD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中大腦固有免疫反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞成分，許多研究聚焦于小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞和分子變化上。在單細(xì)胞中進(jìn)行的全基因組轉(zhuǎn)錄組研究，以及在動(dòng)物模型和人類組織中進(jìn)行的空間轉(zhuǎn)錄組研究，在先前討論的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素的影響之外，以空間和時(shí)間的方式重新審視小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)AD發(fā)病機(jī)制中的作用。在淀粉樣蛋白沉積的背景下，DAM（也稱為MGnD）和吞噬細(xì)胞小膠質(zhì)細(xì)胞可以限制淀粉樣蛋白相關(guān)的病理，并抑制Aβ介導(dǎo)的tau種植和擴(kuò)散。對(duì)雄性和雌性AppNL-G-F小鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的單細(xì)胞研究表明，隨著時(shí)間的推移，會(huì)出現(xiàn)從DAM到具有活化反應(yīng)小膠質(zhì)細(xì)胞（ARMs）和IFN反應(yīng)小膠質(zhì)細(xì)胞（IRMs）的額外小膠質(zhì)細(xì)胞群的轉(zhuǎn)變。ARMS和IRMS是健康衰老過(guò)程中小膠質(zhì)細(xì)胞正常進(jìn)化的一部分，而Aβ促進(jìn)了體內(nèi)平衡的小膠質(zhì)細(xì)胞重新分布到ARM，這豐富了與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）II類呈遞相關(guān)的基因（H2-AB1、H2-AA和CD74）以及已知的AD風(fēng)險(xiǎn)基因，如ApoE、TREM2、DAP12、CTSB和Spp1。APOE-/-使具有ARM特征的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，并影響了小膠質(zhì)細(xì)胞與Aβ斑塊的相互作用，證明了ApoE的直接免疫調(diào)節(jié)功能。盡管在AD和小鼠AD病理模型中看到的小膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)譜有一些重疊，MHC-II基因CD74和HLA-DRB1以及APOE的表達(dá)增加，但并不完全重合。對(duì)AppNL-G-F小鼠模型和人腦切片的空間轉(zhuǎn)錄研究揭示了斑塊誘導(dǎo)的基因、信號(hào)（包含補(bǔ)體、內(nèi)酶體和溶酶體）、氧化和炎癥以及與原位Aβ相關(guān)的原位細(xì)胞生態(tài)位。在tau積累的背景下，反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞和DAM/MGnD顯示出與tau病理和CNS損傷密切相關(guān)的特征性基因表達(dá)模式。在tau介導(dǎo)的神經(jīng)變性發(fā)生時(shí)，抑制對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞生存至關(guān)重要的集落刺激因子1受體（CSF1R），使小膠質(zhì)細(xì)胞枯竭而顯著減少腦萎縮和神經(jīng)元丟失。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞，包括DAM、ARM和IRM，除了影響tau病理和神經(jīng)元丟失外，還可以直接分泌細(xì)胞因子，并可能通過(guò)多種機(jī)制介導(dǎo)突觸破壞，包括上述與先天免疫相關(guān)的信號(hào)通路。因此，監(jiān)測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)變和開(kāi)發(fā)針對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)毒性和炎癥途徑的特定化合物可以用來(lái)給AD分期并制定減緩或阻止AD進(jìn)展的策略（圖2）。

圖2：小膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)和AD相關(guān)功能轉(zhuǎn)移的模型

在AD動(dòng)物模型和人類的大腦中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了白細(xì)胞亞群，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。中性粒細(xì)胞通常是急性炎癥的第一線先天免疫細(xì)胞，它們也有助于慢性炎癥和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。通過(guò)Ly6C/G熒光標(biāo)記抗體的體內(nèi)成像，在5xFAD小鼠中觀察到中性粒細(xì)胞滲透到腦實(shí)質(zhì)并遷移到淀粉樣斑塊。中性粒細(xì)胞黏附于5xFAD和3xTg-AD小鼠的腦血管，并在LFA-1整合素依賴的黏附中遷移到實(shí)質(zhì)中。通過(guò)LFA-1整合素阻斷中性粒細(xì)胞耗竭或抑制中性粒細(xì)胞的運(yùn)輸可以減少3xTg-AD小鼠的斑塊病理和記憶衰退。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是骨髓來(lái)源的髓系細(xì)胞，在血液中循環(huán)或在組織中繁殖?；贑CR2和Ly6C的表達(dá)，促炎癥單核細(xì)胞（CCR2 High Ly6Chigh）根據(jù)炎癥信號(hào)被招募到組織中，而抗炎單核細(xì)胞（CCR2 LowLy6Clow）在血管腔中巡游。體內(nèi)成像研究表明，Ly6Clow單核細(xì)胞被吸引并爬行到Aβ陽(yáng)性靜脈的管腔壁上。選擇性敲除APP/PS1小鼠的Ly6Clow單核細(xì)胞導(dǎo)致Aβ沉積。在AD和AD病理模型的腦實(shí)質(zhì)中，浸潤(rùn)性單核細(xì)胞或單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞在腦實(shí)質(zhì)中的存在程度尚不清楚。如果浸潤(rùn)的單核細(xì)胞或單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞確實(shí)進(jìn)入了AD大腦，它們的來(lái)源，如何將它們與腦內(nèi)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)，以及它們對(duì)Aβ或tau相關(guān)的病理是有利還是有害仍然未知。

08

AD患者腦實(shí)質(zhì)重建適應(yīng)生態(tài)

T和B細(xì)胞表達(dá)的受體具有識(shí)別來(lái)自病原體、腫瘤和疾病狀態(tài)的不同抗原的潛力，并保持免疫記憶和自我耐受性。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者死后組織以及Aβ和tau小鼠模型中腦脊液、軟腦膜和海馬區(qū)的T細(xì)胞增加。AD患者以CD8+T細(xì)胞為主，而不是CD4+T細(xì)胞，海馬區(qū)及其他邊緣結(jié)構(gòu)的T細(xì)胞數(shù)量較多，病理改變較重，提示神經(jīng)元損傷與T細(xì)胞積聚密切相關(guān)。然而，在非AD癡呆患者的海馬區(qū)也發(fā)生了神經(jīng)元丟失，T細(xì)胞與斑塊或NFTs的關(guān)系并不一致。在另一項(xiàng)研究中，在AD患者的大腦中觀察到CD8+T細(xì)胞，尤其是在海馬區(qū)，表現(xiàn)為tau而不是Aβ病理。這些發(fā)現(xiàn)表明了T細(xì)胞在AD進(jìn)展中的潛在作用，但T細(xì)胞在腦實(shí)質(zhì)中的積聚需要復(fù)雜的疾病和免疫環(huán)境。有趣的是，在衰老的小鼠和人類中也觀察到T細(xì)胞的滲透。衰老大腦中的T細(xì)胞克隆性擴(kuò)張，并有別于相應(yīng)外周血中的T細(xì)胞，這表明它們可能識(shí)別衰老大腦中的特定抗原。研究表明帕金森病小鼠模型和患者大腦中的T細(xì)胞對(duì)a-突觸核蛋白有特異性反應(yīng)。這表明在神經(jīng)退行性疾病中可能存在共同的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。特定的抗原，如抗體、不同修飾形式的tau，或受損神經(jīng)元釋放的蛋白質(zhì)或髓鞘碎片，是否被提呈給AD的適應(yīng)性免疫細(xì)胞，仍然是一個(gè)主要的問(wèn)題。在單細(xì)胞水平上對(duì)TCR進(jìn)行測(cè)序，結(jié)合高通量肽篩選，將能夠闡明特異性抗原，進(jìn)而可能產(chǎn)生針對(duì)病理階段的治療策略。

越來(lái)越多的遺傳和功能證據(jù)強(qiáng)烈表明，適應(yīng)性免疫在AD發(fā)病機(jī)制和疾病進(jìn)展中既有有益的作用，也有有害的作用，盡管尚不清楚這些影響是直接的還是間接的。對(duì)缺乏T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞的RAG-/--5xFAD小鼠外周免疫細(xì)胞群進(jìn)行基因消融，可顯著促進(jìn)Aβ病理，增強(qiáng)神經(jīng)炎癥，使小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多，減少小膠質(zhì)細(xì)胞突起分支，削弱小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能。相反，IgG的替代或骨髓移植逆轉(zhuǎn)了這些效應(yīng)并減少了Aβ的病理學(xué)，表明外周適應(yīng)性免疫參與了AD的發(fā)病。在另一項(xiàng)研究中，Rag2-/--APP/PS1△E9小鼠的纖維狀A(yù)β沉積和總Aβ顯著減少，而隨著APP/PS1DE9小鼠的Rag2-/-骨髓重建，小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬Aβ的能力明顯增強(qiáng)，提示Aβ病理減少伴隨著T和B細(xì)胞的缺失。通過(guò)抗CD8抗體治療去除CD8+T細(xì)胞既沒(méi)有改變斑塊病理也沒(méi)有改善認(rèn)知能力，但改變了APP/PS1△E9小鼠神經(jīng)元和突觸相關(guān)基因的表達(dá)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）在抑制過(guò)度免疫反應(yīng)和自身耐受方面起著至關(guān)重要的作用。在5xFAD小鼠和AD患者的外周血中觀察到FoxP3+Treg細(xì)胞升高。在5xFAD小鼠中，通過(guò)將Treg細(xì)胞與FoxP3-白喉毒素（DTX）受體雜交，然后給予DTX或藥物抑制Tregs來(lái)耗盡Treg細(xì)胞，增加了單核/單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的浸潤(rùn)，減輕了Aβ病理、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，并改善了5xFAD小鼠的空間學(xué)習(xí)。在APP/PS1小鼠的實(shí)質(zhì)中存在Th1和Th17細(xì)胞，是Aβ特異的Th1細(xì)胞而不是Th17細(xì)胞產(chǎn)生高水平的干擾素-γ，從而增加CD11b的表達(dá)和Aβ的沉積，并損害這些小鼠的認(rèn)知功能。在ICV注射Th1細(xì)胞的APP/PS1△E9小鼠中觀察到相反的結(jié)果，降低了斑塊負(fù)荷。B細(xì)胞也是一個(gè)異質(zhì)群體。雖然沒(méi)有直接證據(jù)表明AD模型小鼠腦實(shí)質(zhì)中存在B細(xì)胞，但在3xTg AD小鼠的脾和頸淋巴結(jié)中，活化的B細(xì)胞增加，包括CD5+CD11b+CD19+ B1a和CD5-CD11b+CD19+ B1b細(xì)胞。3XTg或APP/PS1小鼠與JHT小鼠雜交，獲得B細(xì)胞缺陷小鼠。這些小鼠在認(rèn)知測(cè)試和運(yùn)動(dòng)活動(dòng)方面有所改善。B細(xì)胞缺陷型AD小鼠Aβ負(fù)荷降低，TGF-β+小膠質(zhì)細(xì)胞增多。用抗CD20/B220抗體去除活化的B細(xì)胞可改善5xFAD小鼠中與Aβ相關(guān)的AD病理。

綜上所述，適應(yīng)性免疫除了直接影響神經(jīng)元的活性外，還影響病理并與先天免疫相互作用，進(jìn)而影響神經(jīng)退行性變，表明適應(yīng)性免疫是Aβ發(fā)病機(jī)制中的重要組成部分。然而，仍有其他問(wèn)題有待回答，其中一些涉及（1）AD進(jìn)展過(guò)程中適應(yīng)性免疫變化的時(shí)間特征及考慮靶向適應(yīng)性免疫系統(tǒng)進(jìn)行干預(yù)的合適時(shí)間窗；（2）特定的淋巴細(xì)胞亞群，包括但不限于效應(yīng)CD4+T細(xì)胞（Th1、Th2、Th17）、Treg、細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞、衰竭的CD8+T細(xì)胞、腦內(nèi)駐留的T細(xì)胞和其他主要潛在的免疫介質(zhì)；以及（3）適應(yīng)性免疫和先天性免疫在AD不同階段的相互作用。

09

先天性免疫和適應(yīng)性免疫在AD中的相互作用

在穩(wěn)態(tài)條件下，Treg和效應(yīng)T細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用，以及它們分泌的抗炎或促炎細(xì)胞因子，包括IL-10、TGF-β、IL-4和IFN-γ。神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或巨噬細(xì)胞等位于神經(jīng)退行性或衰老生態(tài)位的腦內(nèi)細(xì)胞可產(chǎn)生細(xì)胞因子、神經(jīng)毒性活性氧（ROS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS），導(dǎo)致腦實(shí)質(zhì)神經(jīng)炎癥級(jí)聯(lián)，從而導(dǎo)致T細(xì)胞入侵。同時(shí)，隨著腦環(huán)境的變化，包括腦屏障的變化，腦膜（軟腦膜血管）、BBB（實(shí)質(zhì)血管）和血CSF屏障（脈絡(luò)叢）由于其粘附分子配體和整合素的高表達(dá)，可以打開(kāi)通向T細(xì)胞的大門。這些活化的T細(xì)胞分泌促炎和神經(jīng)毒性介質(zhì)，使炎癥級(jí)聯(lián)持久，并誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變，這可能引發(fā)或加速腦萎縮。作者和其他人的研究發(fā)現(xiàn)了一種小膠質(zhì)細(xì)胞群體，特別是在tau病理存在時(shí)，其CD80、CD86、MHC-I和MHC-II復(fù)合體基因（如H2-D1、B2m和H2-DM）的表達(dá)很高。這種“樹(shù)突狀細(xì)胞樣”的小膠質(zhì)細(xì)胞群是否在這種AD樣疾病狀態(tài)下對(duì)T細(xì)胞的抗原呈遞起作用，以及它們與T細(xì)胞亞群的相互作用，都需要進(jìn)一步研究

AD腦萎縮的區(qū)域進(jìn)展與tau蛋白積累高度相關(guān)，但與淀粉樣蛋白沉積無(wú)關(guān)。在AD病理模型系統(tǒng)中，T細(xì)胞是否與神經(jīng)退行性變相關(guān)或直接促進(jìn)神經(jīng)退行性變?nèi)圆磺宄?。如果它們被證明參與介導(dǎo)神經(jīng)退行性變，它們是否可以作為治療AD的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)也是一個(gè)有趣的問(wèn)題。針對(duì)PD-1/PDL1通路的免疫封鎖可改變導(dǎo)致AD和癡呆的常見(jiàn)病理因素。研究表明，該途徑可能涉及Aβ和tauopathy模型的認(rèn)知功能。T細(xì)胞是釋放IFNs特別是IFN-γ的主要細(xì)胞群，在其局部浸潤(rùn)和釋放細(xì)胞因子后，其固有免疫和適應(yīng)性免疫可能有很強(qiáng)的細(xì)胞間通訊，因此在疾病狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。IFN，特別是IFN-γ信號(hào)是否可以通過(guò)IFN-γ的中和或針對(duì)IFNGR的遺傳或操縱作為AD潛在的治療靶點(diǎn)，特定細(xì)胞類型（如小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元）中的IFN-γ受體需要進(jìn)一步研究。因此，在未來(lái)的研究中應(yīng)進(jìn)一步探討適應(yīng)性免疫與Tau蛋白病和神經(jīng)變性以及腦實(shí)質(zhì)中的免疫微環(huán)境的作用。這將有助于發(fā)現(xiàn)適應(yīng)性免疫影響神經(jīng)退行性變的直接證據(jù)。

10

外周和大腦之間的交互

顯然，大腦并不孤立，外圍和大腦可能會(huì)雙向交叉對(duì)話。涉及外周和大腦之間如何進(jìn)行通信的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)可能包括但不限于迷走神經(jīng)感覺(jué)傳入，腦源性物質(zhì)進(jìn)入血液并與外周免疫細(xì)胞通信，外周免疫細(xì)胞或活性因子與腦內(nèi)皮或血管巨噬細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞通信，以及外周免疫細(xì)胞直接滲透到腦實(shí)質(zhì)。值得注意的是，研究已經(jīng)確定衰老、糖尿病、晝夜節(jié)律和睡眠功能障礙以及腸道微生物群是阿爾茨海默病的危險(xiǎn)因素，它們會(huì)影響全身感染和炎癥以及包括阿爾茨海默病在內(nèi)的慢性神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展。外周炎癥刺激誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫耐受，反過(guò)來(lái)通過(guò)給3個(gè)月大的APP23小鼠單次或連續(xù)4天注射LPS注射促進(jìn)或減輕Aβ沉積，并在6個(gè)月后進(jìn)行分析。結(jié)果，小膠質(zhì)細(xì)胞的表觀遺傳修飾導(dǎo)致外周免疫訓(xùn)練刺激下HIF-1和mTOR信號(hào)上調(diào)。在APP/PS1小鼠中，全身炎癥改變了小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，并以NLRP3依賴的方式損害了Aβ清除。清醒度的增加也會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元活動(dòng)增加和Aβ產(chǎn)生增加，抑制類淋巴系統(tǒng)功能和Aβ及tau的清除。腸道菌群調(diào)節(jié)Aβ病理和小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)。早期抗生素對(duì)雄性APPPS1-21小鼠腸道微生物群的干擾導(dǎo)致Aβ斑塊病理的減少和斑塊相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞表型的改變。

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總結(jié)和展望

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性質(zhì)需要它自己專門的免疫反應(yīng)來(lái)檢測(cè)和應(yīng)對(duì)環(huán)境變化。在穩(wěn)態(tài)條件下，小膠質(zhì)細(xì)胞和其他先天免疫細(xì)胞駐留并監(jiān)視腦實(shí)質(zhì)，清除細(xì)胞碎片，維持局部微環(huán)境穩(wěn)態(tài)。這對(duì)正常的突觸活動(dòng)和連接至關(guān)重要。完整的血腦屏障、腦膜層、CSF/ISF流體流動(dòng)和硬腦膜淋巴系統(tǒng)共同工作，保護(hù)大腦具有相對(duì)免疫特權(quán)，并作為邊界免疫細(xì)胞庫(kù)與外周和腦實(shí)質(zhì)的免疫系統(tǒng)通信。在AD中，Aβ和tau的積累，以及由這些蛋白聚集誘導(dǎo)的損傷，依次導(dǎo)致腦實(shí)質(zhì)中的免疫系統(tǒng)激活，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性變化，大腦邊界免疫細(xì)胞的變化，包括血腦屏障病理，腦膜免疫細(xì)胞變化和淋巴引流系統(tǒng)功能障礙。同時(shí)，這些保護(hù)結(jié)構(gòu)的功能障礙可能導(dǎo)致外周免疫細(xì)胞，特別是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)細(xì)胞異位浸潤(rùn)到腦實(shí)質(zhì)，從而導(dǎo)致AD的全新免疫環(huán)境。AD患者的先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)都有變化，這些變化表現(xiàn)為不同的病理、疾病階段和嚴(yán)重程度，其中抗炎和促炎作用都在發(fā)生，并可能以重要的方式促進(jìn)AD的發(fā)生和進(jìn)展。先天和適應(yīng)性免疫效應(yīng)的協(xié)同活動(dòng)對(duì)于形成適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)至關(guān)重要。更好地理解適應(yīng)性免疫在中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫環(huán)境中的作用，將加深我們對(duì)適應(yīng)性免疫效應(yīng)因子以及先天和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的相互作用如何促進(jìn)AD的發(fā)展和進(jìn)展的理解。

盡管在對(duì)AD病理生理學(xué)的理解和潛在治療干預(yù)的發(fā)展方面取得了重大進(jìn)展，特別是針對(duì)Aβ，但AD臨床癥狀期的基本機(jī)制仍然難以捉摸。更好地理解先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在AD病理過(guò)程中的具體作用，特別是在AD的tau介導(dǎo)期，可能會(huì)產(chǎn)生針對(duì)AD臨床前和臨床癥狀期的新的干預(yù)策略。繪制先天免疫和適應(yīng)性免疫（尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞和T細(xì)胞）之間的疾病狀態(tài)特異性相互聯(lián)系，包括它們?nèi)绾谓涣鳌⒖乖蔬f和其病理生理反應(yīng)，將是建立獨(dú)特的治療干預(yù)措施以預(yù)防或逆轉(zhuǎn)AD和原發(fā)性tau病中的神經(jīng)退行性變的關(guān)鍵所在。

精讀文獻(xiàn)請(qǐng)下載原文：

Chen X, Holtzman DM. Emerging roles of innate and adaptive immunity in Alzheimer's disease. Immunity. 2022 Dec 13;55(12):2236-2254.

發(fā)布于：陜西