隨著生活水平的提高，代謝相關(guān)脂肪性肝?。跰AFLD，曾用名非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）］正成為慢性肝病的首要原因［1］。MAFLD是指從非酒精性單純性脂肪肝（NAFL）到非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和脂肪性肝硬化的廣泛性肝臟損傷，其中，NASH是指與炎癥、肝細(xì)胞損傷和纖維化有關(guān)的肝臟脂肪變性［2］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，普通成人MAFLD的患病率在6.3%～45%，其中有10%～30%為NASH，而NASH患者在10～15年內(nèi)肝硬化發(fā)生率高達(dá)15%～25%［3］。NASH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究認(rèn)為與遺傳因素、胰島素抵抗、脂代謝、氧化應(yīng)激和炎性細(xì)胞因子等相關(guān)［4］。目前，對(duì)NASH的防治手段主要為改善飲食及加強(qiáng)鍛煉，在臨床上，現(xiàn)有的藥物大多只能起輔助治療作用［3］。

隨著中醫(yī)藥的現(xiàn)代研究，傳統(tǒng)中藥抗NASH的研究逐漸增多，其調(diào)治機(jī)制具有多途徑、多靶點(diǎn)、安全性高等特點(diǎn)［5］。逍遙散出自宋代《太平惠民和劑局方》，由柴胡、白術(shù)、白芍、薄荷、當(dāng)歸、茯苓、甘草和生姜組成，具有調(diào)和脾胃、疏肝解郁、養(yǎng)血健脾的功效，為調(diào)肝養(yǎng)血之名方，臨床上多用于肝病的治療［6］。近年在臨床應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)逍遙散在MAFLD治療中，能有效控制疾病進(jìn)一步發(fā)展［7-9］。徐慧超等［10］發(fā)現(xiàn)逍遙散可上調(diào)TLR4水平并下調(diào)TLR4/TRIF/p65表達(dá)從而改善NASH癥狀。但因MAFLD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，針對(duì)逍遙散治療MAFLD的相關(guān)機(jī)制尚未進(jìn)行系統(tǒng)性報(bào)道。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法，分析逍遙散的物質(zhì)基礎(chǔ)，系統(tǒng)挖掘逍遙散治療MAFLD的作用機(jī)制，為逍遙散臨床應(yīng)用及開發(fā)研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1　網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

1.1　逍遙散活性成分及靶點(diǎn)的確定

通過TCMSP檢索并經(jīng)文獻(xiàn)補(bǔ)充后，得到逍遙散活性成分172個(gè)，其中柴胡17個(gè)、當(dāng)歸7個(gè)、白芍18個(gè)、白術(shù)8個(gè)、茯苓15個(gè)、甘草92個(gè)、薄荷10個(gè)、生姜5個(gè)，刪除重復(fù)值后獲得活性成分160個(gè)。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取及Swiss Target數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫規(guī)范化處理，得到活性成分作用靶點(diǎn)柴胡200個(gè)、當(dāng)歸98個(gè)、白芍252個(gè)、白術(shù)79個(gè)、茯苓200個(gè)、甘草368個(gè)、薄荷126個(gè)、生姜141個(gè)，刪除重復(fù)項(xiàng)后，獲得上述活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)619個(gè)。

1.2　逍遙散治療MAFLD相關(guān)靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

經(jīng)GeneCards數(shù)據(jù)庫及OMIN數(shù)據(jù)庫共搜集得到589個(gè)MAFLD疾病靶點(diǎn)。將獲得的藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，得到133個(gè)逍遙散治療MAFLD的潛在作用靶點(diǎn)，見圖1。

1.3　逍遙散活性成分-MAFLD靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)上傳至String 11.0平臺(tái)，設(shè)定最小互相作用閾值為“highest confidence”＞0.9，并刪除游離點(diǎn)，最終得到113個(gè)潛在作用靶點(diǎn)參與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，采用Cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。PPI網(wǎng)絡(luò)包含113個(gè)節(jié)點(diǎn)、359條邊，節(jié)點(diǎn)為潛在作用靶點(diǎn)，其大小及顏色深淺與度值呈正相關(guān)，節(jié)點(diǎn)之間的連線表示靶點(diǎn)間存在潛在的作用關(guān)系。如圖2所示，逍遙散可能通過作用于轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）、轉(zhuǎn)錄因子p65（RELA）、絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶（AKT1）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、視黃酸受體（RXRA）、腫瘤壞死因子（TNF）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（TP53）、白細(xì)胞介素6（IL6）等靶點(diǎn)，從而發(fā)揮治療MAFLD的作用。

1.4　逍遙散活性成分-MAFLD靶點(diǎn)GO功能及KEGG通路富集分析

經(jīng)Metascape平臺(tái)分析得到KEGG通路富集結(jié)果256條，選取P＜0.01及排名前20的條目進(jìn)行高級(jí)氣泡圖的繪制，見圖3。逍遙散治療MAFLD的通路可能與影響腫瘤相關(guān)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、非酒精性脂肪肝（NAFLD）相關(guān)信號(hào)通路、丙型肝炎相關(guān)信號(hào)通路、腫瘤壞死因子通路、乙型肝炎相關(guān)信號(hào)通路、動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路等密切相關(guān)。

GO功能富集分析如圖4～6所示，生物過程（BP）富集結(jié)果主要涉及對(duì)無機(jī)物的反應(yīng)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)、對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、一元羧酸代謝過程、平滑肌細(xì)胞增殖、肌細(xì)胞增殖、對(duì)脂多糖的反應(yīng)及平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)控等。分子功能（MF）富集結(jié)果主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、激酶結(jié)合、一元羧酸結(jié)合、羧酸結(jié)合及血紅素結(jié)合等。細(xì)胞成分（CC）富集結(jié)果主要涉及受體復(fù)合體、膜筏、膜微區(qū)、蛋白激酶復(fù)合物、膜側(cè)、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物等。

1.5　逍遙散成分-MAFLD靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建逍遙散成分-MAFLD靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，見圖7。內(nèi)置工具Network Analyzer分析成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，即可得到核心成分和核心作用靶點(diǎn)。

網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)果表明，槲皮素度值為35，介度為0.088 6，緊密度為0.492 2；木犀草素度值為17，介度為0.021 8，緊密度為0.453 6；山柰酚度值為16，介度為0.021 0，緊密度為0.449 9，預(yù)測(cè)此3個(gè)成分為逍遙散治療MAFLD的主要成分，其次為豬苓酸C、蓖麻酸C、柚皮素、乙酸、去氫土莫酸、α-香樹脂醇、茯苓新酸A、去氫齒孔酸、18α-羥基甘草次酸等，見表1。

在構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)圖中，前列腺素G/H合成酶2（PTGS2）度值為117，介度為0.372 9，緊密度為0.604 4；雌激素受體（ESR1）度值為90，介度為0.117 5，緊密度為0.464 1；一氧化氮合酶（NOS2）度值為82，介度為0.109 7，緊密度為0.474 1，預(yù)測(cè)此3個(gè)靶點(diǎn)為逍遙散治療MAFLD的主要靶點(diǎn)。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、RXRA、RELA、AKT1、Caspase-3（CASP3）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、核因子κB激酶亞基β（IKBKB）、IL6、JUN、絲裂原活化蛋白激酶9（MAPK9）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARA）、氧固醇受體LXR-alpha（NR1H3）等也為相對(duì)重要的靶點(diǎn)，見表2。

2　分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果

將“3.1.5”項(xiàng)中篩選得到的度值高的核心靶點(diǎn)（PTGS2、ESR1、NOS2、PPARG）與主要活性成分（槲皮素、木犀草素、山柰酚），采用AutoDock進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，并利用PyMoL軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。一般認(rèn)為，結(jié)合能越低，說明配體與受體的結(jié)合力越強(qiáng)，結(jié)合能≤-20.92 kJ·mol-1表明藥物分子與靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性，結(jié)合能≤-29.29 kJ·mol-1表明藥物分子與靶點(diǎn)具有強(qiáng)的結(jié)合活性［15］。如表3和圖8所示，槲皮素、木犀草素和山柰酚與核心靶點(diǎn)均具有較好的結(jié)合活性，結(jié)合能均＜-20.92 kJ·mol-1，其中槲皮素、木犀草素和山柰酚與核心靶點(diǎn)PTGS2、ESR1的結(jié)合能均＜-29.29 kJ·mol-1，表明活性成分與核心靶點(diǎn)均具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。

3　體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

3.1　逍遙散對(duì)MAFLD小鼠血清中ALT、AST活性及TG、TC水平的影響

如圖9所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中的ALT、AST活性及TG、TC水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，逍遙散低、中、高劑量組小鼠血清中ALT、AST活性和TC水平明顯降低（P＜0.05），逍遙散高劑量組小鼠血清中TG水平明顯降低（P＜0.05），呈濃度相關(guān)性；多烯磷脂酰膽堿組小鼠血清中ALT、AST活性及TG、TC水平均明顯降低（P＜0.01）。

3.2　逍遙散對(duì)MAFLD小鼠肝組織病理變化的影響

如圖10所示，對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，胞核位于細(xì)胞中央且胞質(zhì)染色均勻，無脂肪空泡和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠多量肝細(xì)胞脂肪變性，胞漿可見圓形脂肪空泡，小葉見多處炎性細(xì)胞小灶性浸潤(rùn)；與模型組相比，多烯磷脂酰膽堿組及逍遙散低、中、高劑量組肝細(xì)胞損傷以及炎癥浸潤(rùn)均有不同程度的改善，僅有少量肝細(xì)胞伴有脂肪變性，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象減輕。

3.3　逍遙散對(duì)小鼠肝組織PTGS2、ESR1、NOS2、PPARG蛋白表達(dá)的影響

如圖11所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織中PTGS2、ESR1及NOS2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），PPARG蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組肝組織中ESR1及NOS2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05、0.01），逍遙散中、高劑量組肝組織中PTGS2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，PPARG蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。

　討論

MAFLD是一種慢性進(jìn)行性肝病，其特征是脂肪在肝臟中堆積及炎癥變化，通常會(huì)發(fā)展為肝硬化并增加患肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)［16-17］。MAFLD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝改變、慢性氧化應(yīng)激、炎癥細(xì)胞因子等息息相關(guān)［18-19］。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)并無MAFLD的病名，但根據(jù)臨床癥狀可將其歸屬于肝郁脾虛證、痰濁內(nèi)阻證、濕熱蘊(yùn)結(jié)證及痰瘀互結(jié)證等［20］，其病因多為飲食失節(jié)、多臥少動(dòng)、痰濕內(nèi)阻、肝脾失調(diào)［21］。

逍遙散由柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓、甘草、薄荷和生姜8味中藥組成，具有疏肝養(yǎng)血、健脾和中的功效。方中柴胡疏肝解郁；當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血柔肝；白術(shù)、甘草、茯苓健脾養(yǎng)心；薄荷助柴胡以散肝郁；煨生姜溫胃和中，諸藥合用，可收肝脾并治，氣血兼顧的功效。李紅閣等［22］通過臨床研究表明，MAFLD患者同時(shí)服用辛伐他汀及丹梔逍遙散效果優(yōu)于單用辛伐他汀，能改善患者肝功能并減少肝臟脂肪沉積。逍遙散可改善慢性應(yīng)激大鼠血漿中血糖、胰島素、膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇的異常水平，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其機(jī)制可能與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)［23］。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)［24］和分子對(duì)接方法初步確認(rèn)逍遙散治療MAFLD的活性成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚及豬苓酸C等。槲皮素為柴胡和甘草的共有成分，能減少肝臟中脂質(zhì)積累，進(jìn)一步研究表明，槲皮素還可通過激活FXR1/TGR5信號(hào)通路從而調(diào)節(jié)MAFLD的脂質(zhì)代謝［25］。木犀草素為薄荷的主要成分，能減少肝臟的炎癥介質(zhì)水平，增強(qiáng)Ⅱ期酶活性，抑制NF-κB和AP-1的激活，進(jìn)而抑制MAFLD的形成［26］。山柰酚為柴胡、白芍、甘草的共有成分，可有效地減輕肝纖維化的形成，其機(jī)制與抑制肝星狀細(xì)胞活化，進(jìn)而抑制肝星狀細(xì)胞膠原蛋白的合成相關(guān)［27］。豬苓酸C為茯苓的主要成分，文獻(xiàn)報(bào)道［28］其為潛在的RXR選擇性激動(dòng)劑，RXR激動(dòng)劑具有治療代謝疾病的潛力，能調(diào)節(jié)葡萄糖代謝及抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá)［29］。這些研究表明逍遙散可通過多種途徑治療MAFLD。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，逍遙散治療MAFLD的靶點(diǎn)主要集中于PTGS2、ESR1、NOS2、PPARG、RXRA、RELA等。

PTGS2在花生四烯酸合成前列腺素途徑中起關(guān)鍵作用。在受到細(xì)胞因子、細(xì)菌等多種炎癥因子刺激后，PTGS2可引發(fā)炎癥并促進(jìn)前列腺素的合成，過度的炎癥會(huì)造成肝損傷，導(dǎo)致肝纖維化或肝硬化［30］。

ESR1即雌激素受體α，其介導(dǎo)的雌激素信號(hào)傳導(dǎo)在脂肪生成的調(diào)節(jié)中起重要作用，ESR1可通過減少肝臟中參與脂質(zhì)合成的一些基因的表達(dá)來防止高脂血癥的發(fā)生［31］。

NOS2為誘導(dǎo)性NOS，在細(xì)胞應(yīng)激或炎癥條件下，NOS2表達(dá)上調(diào)，持續(xù)產(chǎn)生高水平的NO，并且NOS2正向調(diào)節(jié)MMP-9表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血管生成，促進(jìn)肝癌的形成［32］。

PPAR屬于核激素受體超家族，在葡萄糖和脂肪酸代謝中起著舉足輕重的作用，其中PPARG在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中起重要作用，PPARG可通過抑制TNF-α生成和上調(diào)CD36及LPL的表達(dá)來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝［33］。分子對(duì)接結(jié)果顯示，槲皮素、木犀草素及山柰酚與靶點(diǎn)PTGS2、ESR1、NOS2、PPARG結(jié)合能力較好。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明逍遙散可降低MAFLD小鼠肝組織AST、ALT、TG及TC水平，改善肝功能指標(biāo)的作用。HE染色結(jié)果表明逍遙散可減緩MAFLD小鼠肝組織病理變化，肝細(xì)胞損傷以及炎癥浸潤(rùn)均有不同程度的改善，其中逍遙散高劑量組療效較優(yōu)。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果篩選出的靶點(diǎn)進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與模型組相比，逍遙散中、高劑量組小鼠肝組織中PTGS2、ESR1及NOS2蛋白表達(dá)顯著降低，PPARG蛋白表達(dá)顯著升高，提示逍遙散可通過調(diào)控PTGS2、ESR1、NOS2及PPARG等靶點(diǎn)發(fā)揮治療MAFLD作用。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與傳統(tǒng)中醫(yī)藥相結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)逍遙散可通過多通路、多靶點(diǎn)方式治療MAFLD，為臨床運(yùn)用逍遙散治療MAFLD提供了科學(xué)依據(jù)，也有助于闡明逍遙散抗MAFLD的作用機(jī)制，為逍遙散的新藥研發(fā)提供了理論依據(jù)和參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

參考文獻(xiàn)（略）

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