今天給同學們分享一篇單基因確定為肝細胞癌的新型免疫治療靶點的生信文章“System analysis based on the cancer–immunity cycle identifies ZNF207 as a novel immunotherapy target for hepatocellular carcinoma”，這篇文章于2022年5月4日發(fā)表在J Immunother Cancer期刊上，影響因子為12.469。在研究中，作者將生信分析與實驗技術(shù)相結(jié)合，在體外和體內(nèi)評估肝細胞癌（HCC）中的免疫抑制靶點 ZNF207。此外，作者還驗證了它作為抗程序性細胞死亡蛋白 1 (PD1) 治療的生物標志物和聯(lián)合靶標的潛力。最后，作者研究了 ZNF207 異常表達在 HCC 中的作用及其在 CD8+ T 細胞調(diào)節(jié)方面加速 HCC 進展的機制。研究將闡述對激活 HCC 進展機制的理解，并為 HCC 的治療和預后提供潛在的治療靶點。

1. ZNF207 是 HCC 中潛在的免疫抑制靶點

為了在 HCC 中找到潛在的免疫抑制靶點，作者使用癌癥免疫周期評分和 HCC 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行 WGCNA 網(wǎng)絡分析。聚類分析將所有基因分為 20 個模塊。然后，作者對所有模塊進行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)兩個具有相似內(nèi)部表達模式的集群（圖 1A）。brown和 turquoise 分別是簇 1 和 2 中差異最顯著的模塊。為了弄清楚這兩個模塊的功能，作者進行了基因本體注釋分析。turquoise模塊中的基因主要富含 RNA 轉(zhuǎn)運、RNA剪接和紡錘體組裝過程（圖 1D）。為了識別 HCC 中的免疫抑制靶標，作者從兩個標準篩選了turquoise模塊中的核心基因。DEAH 盒蛋白 9 (DHX9) 和 ZNF207 均符合篩選標準（圖 1E）。DXH9 參與由核因子-κB (NF-κB)21 介導的免疫反應，并調(diào)節(jié) Toll 樣受體刺激的免疫反應。因此，主要關(guān)注 ZNF207。總之，數(shù)據(jù)表明 ZNF207 可能是一個潛在的未報告的免疫抑制靶點。

圖1 ZNF207 是 HCC 中潛在的免疫抑制靶點

2. ZNF207 在 HCC 中高表達并與不良預后相關(guān)

HCC的進展通常伴隨著基因表達異常和預后不良。發(fā)現(xiàn)匹配的 HCC 組織中 ZNF207 的表達高于相鄰樣本中的表達（圖 2A）。來自 Oncomine 和 GEO 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)顯示出一致的趨勢（圖 2B、C）。在 HCC 樣本中，ZNF207 在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上均顯示出顯著增加（圖 2D、E）。免疫組織化學 (IHC) 分析顯示 ZNF207 主要在細胞核中過表達(OE)，與其作為轉(zhuǎn)錄因子的作用一致（圖2F）。HCC 患者在 ZNF207 高表達組（圖 2G）中表現(xiàn)出更晚期、分級和 T 分期，以及在多個數(shù)據(jù)集中更短的總體和無病生存結(jié)果（圖 2H）。單因素和多因素 Cox 模型分析進一步揭示 ZNF207 是 HCC 的獨立預后因素?？偟膩碚f，作者的研究結(jié)果表明 ZNF207 在 HCC 中高表達并且與較差的預后相關(guān)。

圖2 ZNF207 在 HCC 中高表達并且與不良預后相關(guān)

3.缺氧會升高 HCC 中的 ZNF207

接下來，作者通過基因集富集分析 (GSEA) 檢查了 ZNF207 如何在 HCC 中上調(diào)。作者發(fā)現(xiàn)“HYPOXIA_VIA_HIF1A_UP”基因特征在 ZNF207high 組中顯著豐富（圖3A）。在實驗上，作者觀察到物理和化學模擬的缺氧都可以提高 ZNF207 的蛋白質(zhì)水平（圖 3B、C ），這可以被缺氧誘導因子 1α (HIF1α) 的抑制劑逆轉(zhuǎn) (BAY87- 2243) 和 HIF2α (PT2385)。相比之下，BAY87-2243 在缺氧條件下對 ZNF207 發(fā)揮更強的抑制作用（圖 3D、E）。在常氧條件下使用質(zhì)粒過表達 HIF1α 和 HIF2α，作者發(fā)現(xiàn)缺氧對 ZNF207 的影響可以重現(xiàn)（圖 3F、G）。為了分析HIF對ZNF207的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，作者進行了雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灐Ｈ毖鹾吐然挿跤荚鰪娏?ZNF207 啟動子基因的熒光強度（圖 3H）。ZNF207 有六個 HIF 共有結(jié)合位點（圖 3I）。在常氧和缺氧條件下，使用抗 HIF2α 抗體對相對于 TSS 位于 –1012/–1017bp 的一個 DNA 序列進行免疫沉淀（圖 3J）。簡而言之，缺氧可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)提高 HCC 中 ZNF207 的表達。

圖3 缺氧會升高 HCC 中的 ZNF207

4.ZNF207 促進與 CD8+ T 細胞浸潤和衰竭相關(guān)的 HCC

為了解 ZNF207 如何促進 HCC 進展，以及它是否與腫瘤免疫相關(guān)，作者首先在實驗中評估了 ZNF207 對細胞增殖的影響。無論 ZNF207-knockdown (KD) 還是 ZNF207-OE，HCC 細胞系的細胞增殖保持不變。此外，ZNF207-KD 或 ZNF207-OE 并未改變免疫缺陷小鼠中異種移植腫瘤的生長速率（圖 4A、B）。這些結(jié)果表明 ZNF207 對于免疫缺陷微環(huán)境中的 HCC 細胞增殖并不重要?；谥暗姆治龊蛯嶒灲Y(jié)果，作者假設肝細胞瘤固有的 ZNF207 可能通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫來促進 HCC 進展。ZNF207-KD 或 ZNF207-OE Hepa1-6 細胞顯著影響腫瘤生長速率，但未顯示體外細胞增殖差異（圖 4C、D）。ZNF207-KD 或 ZNF207-OE 改變了 Ki67 和 CD31 的陽性細胞率，這兩種標記物通常用于評估腫瘤增殖和血管生成。此外，作者干預 H22 誘導的 HCC 原位模型。ZNF207-KD 或 ZNF207-OE 腺相關(guān)病毒 8 顯著改變了免疫活性小鼠（BALB/c 小鼠）中的腫瘤生長（圖 4E）。這些發(fā)現(xiàn)表明 ZNF207 誘導的 HCC 進展與腫瘤免疫相關(guān)。

圖4 ZNF207 促進與 CD8+ T 細胞浸潤和衰竭相關(guān)的 HCC

為了闡明 ZNF207 如何通過腫瘤免疫促進 HCC 的進展，作者對 ZNF207-KD 和對照腫瘤組織進行了流式細胞術(shù)分析。ZNF207-KD 增強 CD8+ T 細胞浸潤并抑制其衰竭（圖 4F）。此外，IHC 證實 ZNF207-KD 腫瘤中 CD8+ T 細胞的比例升高。然后，使用條件培養(yǎng)基在體外模擬ZNF207對T細胞功能的影響。從 ZNF207-KD Hepa1-6 細胞獲得的條件培養(yǎng)基對自然殺傷細胞、B 細胞和巨噬細胞沒有顯著的趨化作用，而對 CD8+ T 細胞表現(xiàn)出顯著的趨化作用（圖 4G）。有趣的是，條件培養(yǎng)基還在體外抑制 CD8+ T 細胞的衰竭（圖 4H ），從而提高其增殖和細胞因子分泌水平（圖 4I）。有趣的是，ZNF207 與 TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)集中衰竭的 T 細胞基因特征和免疫檢查點分子呈正相關(guān)，與實驗結(jié)果一致（圖 4J，K）。上述結(jié)果表明 ZNF207 通過腫瘤免疫增強 HCC 進展，這與 CD8+ T 細胞的浸潤和衰竭相關(guān)。

5. ZNF207 通過 MAPK–CX3CL1 抑制 CD8+ T 細胞浸潤

為了闡明 ZNF207 影響 CD8+ T 細胞浸潤和衰竭的潛在機制，作者對 Hepa1-6-shZNF207 和 Hepa1-6-shNC 細胞進行了 RNA 測序分析。GSEA 顯示，免疫和代謝相關(guān)信號通路在 ZNF207-KD 組中顯著豐富（圖 5A）。此外，趨化因子、細胞因子受體相互作用和 T 細胞受體信號通路被上調(diào)（圖 5B）。隨后，作者通過 RT-qPCR 驗證了免疫相關(guān)通路中基因的上調(diào)。多種細胞因子和趨化因子的上調(diào)表明 ZNF207 可能通過影響細胞因子分泌來改變 T 細胞功能；因此，作者進行了細胞因子陣列比較 Hepa1-6-shZNF207 和 Hepa1-6-shNC 細胞的細胞上清液和裂解物中的 111 種細胞因子。據(jù)報道，幾種細胞因子與 T 細胞趨化性密切相關(guān)，例如 CX3CL1、CXCL1、CXCL10 和 CXCL16，這些細胞因子顯著增加。具體來說，作者主要關(guān)注 CX3CL1，因為它在上清液和裂解液中具有一致的趨勢（圖 5C）。隨后，作者通過 ELISA 證實了細胞上清液中 CX3CL1 的上調(diào)（圖 5D）。此外，在人類 HCC 樣本中觀察到 ZNF207 和 CX3CL1 之間存在強烈的負相關(guān)（圖 5E）。接下來，作者確定 ZNF207-KD 誘導的 CX3CL1 分泌是否對 CD8+ T 細胞趨化性至關(guān)重要。當用 CX3CL1 中和劑處理時，條件培養(yǎng)基對 CD8+ T 細胞的趨化作用減弱（圖 5F）。組合生存分析還顯示，CX3CL1lowZNF207high 組患者的總生存期 (OS) 最差，HR 最高，而 CX3CL1highZNF207low 組患者的生存結(jié)果最好（圖 5G）。這些發(fā)現(xiàn)表明 CX3CL1 在 ZNF207 介導的 CD8+ T 細胞浸潤和 HCC 進展中起重要作用。

圖5 ZNF207 通過 MAPK–CX3CL1抑制 CD8+ T 細胞浸潤

6. ZNF207 通過增加犬尿氨酸水平促進 CD8+ T 細胞衰竭

除了免疫途徑外，多種代謝途徑（主要是氨基酸代謝途徑）顯著豐富（圖 5A）。各種研究報告了代謝物對 T 細胞功能的影響；因此，作者假設 ZNF207 可能通過調(diào)節(jié) CD8+ T 細胞功能影響腫瘤代謝。因此，作者對 Hepa1-6-shZNF207 與 Hepa1-6-shNC 細胞進行了代謝組學分析。與通路富集結(jié)果一致，ZNF207-KD 后各種代謝物下調(diào)，氨基酸是差異代謝物的最大成分（圖 6A）。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes通路富集分析顯示，差異代謝物在色氨酸代謝通路中顯著富集。在 ZNF207-KD 后，色氨酸代謝途徑中的代謝物水平（包括犬尿氨酸）受到顯著抑制（圖 6B）。正如預期的那樣，ZNF207-KD 抑制了細胞上清液中的犬尿氨酸水平，同時增加了穩(wěn)定的 ZNF207 表達（圖 6C）。多項研究表明，腫瘤細胞釋放的犬尿氨酸可誘導 T 細胞衰竭，27–30 這解釋了 ZNF207 如何促進 HCC 中 CD8+ T 細胞衰竭的部分機制。此外，作者將犬尿氨酸添加到 ZNF207-KD 細胞的條件培養(yǎng)基中以監(jiān)測 CD8+ T 細胞衰竭。事實上，犬尿氨酸補充劑顯著誘導 CD8+ T 細胞衰竭（圖 6D）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明犬尿氨酸參與了由 ZNF207 介導的 CD8+ T 細胞衰竭。

圖6 ZNF207 通過增加犬尿氨酸水平促進 CD8+ T 細胞衰竭

7. ZNF207 轉(zhuǎn)錄調(diào)控IDO1以促進犬尿氨酸的產(chǎn)生

為了解 ZNF207 如何改變?nèi)虬彼岽x，作者關(guān)注犬尿氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵基因，這些基因在 ZNF207-KD 組中顯著下調(diào)。ZNF207 表達僅提高 IDO1 的 mRNA 水平，但不提高 IDO2 或 TDO2?；谶@些發(fā)現(xiàn)，作者假設 ZNF207 可以轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) IDO1。作者使用雙熒光素報告基因?qū)嶒瀬硌芯窟@個猜想，當 IDO1 啟動子-熒光素酶質(zhì)粒與 ZNF207-OE 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時，顯示熒光強度增加（圖 6E）。ChIP-qPCR 證實 ZNF207 可以結(jié)合 IDO1 啟動子的三個區(qū)域（圖 6F）。用特異性抑制劑 PF-06840003 抑制 IDO1 可逆轉(zhuǎn)由 ZNF207 表達介導的犬尿氨酸水平（圖 6G）。此外，PF-06840003 治療逆轉(zhuǎn)了由 ZNF207-OE 細胞系的條件培養(yǎng)基引起的 CD8+ T 細胞衰竭（圖 6H）。體內(nèi)實驗表明，PF-06840003 治療逆轉(zhuǎn)了 ZNF207-OE 的腫瘤生長促進作用，反映了 IDO1 通路在 ZNF207 介導的 HCC 生長中的關(guān)鍵作用?？傊髡咦C明 ZNF207 可以轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) IDO1 以提升犬尿氨酸并誘導 CD8+ T 細胞衰竭。

8. ZNF207 是聯(lián)合抗 PD1 療法的潛在治療靶點

在這項研究中，作者發(fā)現(xiàn) ZNF207 可以通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫來促進 HCC 的進展。因此，作者進一步研究了 ZNF207 作為 HCC 患者聯(lián)合抗 PD1 治療的治療靶點的潛力。盡管單獨使用抗 PD1 治療可以抑制腫瘤生長，但 ZNF207-KD 聯(lián)合 PD1 單克隆抗體表現(xiàn)出顯著的腫瘤抑制效果（圖 7A-C）。ZNF207-KD 加抗 PD1 治療組中 PCNA 陽性細胞的百分比最低，而浸潤性 T 細胞顯著增加（圖 7D）。為了進一步研究 ZNF207 在預測免疫治療反應性方面的價值，作者使用腫瘤免疫功能障礙和排斥 (TIDE) 和 Submap 算法，從 TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)集中預測具有不同 ZNF207 表達的患者的免疫治療反應率（圖 7E )。ZNF207 高表達組中只有 21.6% 的患者對免疫療法有反應，而 ZNF207 低表達組中這一比例為 70.3%（圖 7F）。此外，與 CTLA-4 單克隆抗體相比，ZNF207 低表達組患者對 PD1 單克隆抗體治療的反應更好（圖 7G）。接下來，作者還通過將患者分配到兩個 PD1 抗體治療隊列中的高或低 ZNF207 組來評估 ZNF207 對免疫檢查點治療的預后價值。GSE78220 隊列（PD1 治療隊列）的ROC分析顯示 ZNF207 是抗 PD1 療法療效的預測性生物標志物。綜上所述，作者的研究結(jié)果表明 ZNF207 可以作為 HCC 抗 PD1 療法的生物標志物和治療靶點。

圖7 ZNF207 是抗 PD1 治療的潛在聯(lián)合靶點

總結(jié)

了解腫瘤免疫過程對于篩選癌癥中的免疫抑制靶點至關(guān)重要。作者使用癌癥免疫周期評分來量化免疫周期過程，結(jié)合 WGCNA 和系統(tǒng)分析，將 ZNF207 鑒定為 HCC 中的免疫抑制靶點。作者的體內(nèi)動物實驗表明，ZNF207-KD 聯(lián)合抗 PD1 療法在 HCC 中具有強大的治療潛力。