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編譯：微科盟-草重木雪，編輯：微科盟Emma、江舜堯。 微科盟原創(chuàng)微文，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載。 導(dǎo)讀
苗酸湯（MSS）是貴州黔東南地區(qū)的一種發(fā)酵產(chǎn)品，富含多種有益成分，在全中國廣泛食用。發(fā)酵食品有益于身體健康，對單純性肥胖有潛在的積極調(diào)節(jié)作用。在本研究中，我們通過蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析了MSS預(yù)防高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的單純性肥胖的作用機(jī)制。我們采用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)和液相色譜-質(zhì)譜分析MSS干預(yù)后肝臟蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物的變化。MSS干預(yù)上調(diào)了33種蛋白質(zhì)和9種代謝產(chǎn)物，下調(diào)了19種蛋白質(zhì)和10種代謝產(chǎn)物。生物信息學(xué)分析表明，MSS可以通過作用于PPAR信號通路、視黃醇代謝、脂肪酸b氧化、脂肪酸降解、脂肪酸生物合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、丙酮酸代謝、檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）和其他信號通路來預(yù)防單純性肥胖。這項(xiàng)研究為使用MSS預(yù)防由高脂肪飲食引起的單純性肥胖以及使用MSS尋找健康飲食模式提供了新的見解。 原名：Integrative proteomics and metabolomics of Guizhou Miao Sour Soup affecting simple obese rats譯名：貴州苗酸湯對單純性肥胖大鼠的綜合蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究
期刊：Frontiers in
Nutrition通訊作者單位：貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與健康學(xué)院和貴州省食品營養(yǎng)與健康工程研究中心
我們評估了MSS對喂養(yǎng)高脂飲食的大鼠體重和體脂肪沉積的影響，如圖1A–D所示。在實(shí)驗(yàn)開始前，50只大鼠被分為5組，分別為正常飲食（ND）組，正常飲食加MSS處理12周（NDS）組，高脂飲食組（HFD）組，高脂飲食加MSS處理12周（HFDS）組，以及高脂飲食加6周MSS處理后再用去離子水處理6周（HFDIS）組，在第12周結(jié)束時，五組之間的體重沒有差異（P>0.05）。HFD組的體重高于ND組（P<0.05），HFDS組的體重低于HFD組和HFDIS組（P<0.05），HFDIS組與HFD組的體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。此外，HFD組的肥胖指數(shù)、Lee’s指數(shù)和肝臟指數(shù)高于ND組和HFDS組（P<0.05），與HFDIS組無差異（P>0.05），HFDS組低于HFDIS（P<0.05）。ND組與NDS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果表明，MSS的干預(yù)降低了高脂飲食喂養(yǎng)大鼠的體重增加和體脂肪沉積。
圖1 苗酸湯對高脂飲食喂養(yǎng)大鼠體重和脂肪沉積的影響（A）12周內(nèi)大鼠的體重。（B）大鼠脂肪指數(shù)。（C）老鼠Lee’s指數(shù)。（D）大鼠肝臟指數(shù)。ND：正常飲食+蒸餾水（12周）；NDS：正常飲食+MSS（12周）；HFD：高脂飲食+蒸餾水（12周）；HFDS：高脂飲食+MSS（12周）；HFDIS：高脂飲食+MSS（前6周），然后蒸餾水（后6周）。*p<0.05表示有顯著差異，ns表示無顯著差異（ND vs. NDS，HFD；HFD vs. HFDS，HFDIS；HFDS vs. HFDIS）。我們檢測了肥胖大鼠血脂水平和FBG的變化，以評估MSS對糖脂代謝的影響。圖2A–E顯示了各組中TG、TC、LDL-C、HDLC和空腹血糖（FBG）的結(jié)果，如圖所示，HFD組的血清TG、TB、LDL-C和FBG高于ND組（P<0.05），HDL-C濃度降低（P<0.05）。HFDS組的血清TG、TC、LDL-C和FBG低于HFD組（P<0.05），但HDL-C升高（P<0.05）。ND組和NDS組之間以及HFDIS組和HFD組之間的TG、TC、LDL-C、HDL-C和FBG結(jié)果無差異（P>0.05）。肝臟H&E（圖2F）和油紅O（圖2G）染色結(jié)果顯示，ND和NDS組的肝細(xì)胞形狀正常，排列整齊，未觀察到明顯異常。HFDIS組在MSS灌胃干預(yù)6周后改為蒸餾水，HFDS組完成為期12周的干預(yù)。HFDIS組與HFD組相似，細(xì)胞脂肪變性明顯，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大小不等的圓形空泡，表明MSS的整體干預(yù)可以有效改善肝臟脂肪沉積。
圖2 MSS對HFD喂養(yǎng)大鼠血脂水平、空腹血糖（FBG）和肝臟脂肪形成的影響（A）甘油三酯（TG）。（B）總膽固醇（TC）。（C）低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。（D）高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。（E）空腹血糖。（F）大鼠肝臟HE染色的代表性圖像，紅色箭頭指向脂肪泡。（G）大鼠肝臟油紅O染色的代表性圖像，綠色箭頭指向脂肪沉積。p<0.05表示有顯著性差異，ns表示無顯著性差異。為了揭示MSS對高脂飲食引起的單純性肥胖大鼠的具體作用機(jī)制，我們對五組大鼠的肝臟進(jìn)行了TMT定量蛋白質(zhì)組分析。主成分分析（PCA）顯示了組間和組內(nèi)的差異（圖3A）。該結(jié)果中共鑒定出7218個蛋白質(zhì)。聚類熱圖的結(jié)果顯示各組之間不同蛋白質(zhì)表達(dá)的差異（圖3B），紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)。其中，與HFD組相比，HFDS組中有76個蛋白上調(diào)，50個蛋白下調(diào)（圖3C）。KEGG途徑分析表明，這些差異蛋白主要參與生物過程，如脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝反應(yīng)（圖3D）。HFDS組較HFD組上調(diào)33個蛋白表達(dá)，而HFD組較ND組下調(diào)33個蛋白表達(dá)。HFDS組較HFD組有19個蛋白表達(dá)下調(diào)，而HFD組較ND組有19個蛋白表達(dá)上調(diào)(表1)。
圖3 使用蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定和分析HFD喂養(yǎng)大鼠肝臟中的差異表達(dá)蛋（DEPs）（A）所有肝臟樣品的定量蛋白質(zhì)主成分分析（PCA）結(jié)果。（B）DEPs的聚類圖。紅色和綠色分別代表顯著的向上和向下調(diào)。（C）HFDS與HFD組的火山圖。紅點(diǎn)和綠點(diǎn)分別代表顯著上調(diào)和下調(diào)的差異蛋白。黑點(diǎn)表示沒有差異的蛋白質(zhì)。（D）DEPs前20個KEGG富集途徑的氣泡圖。倍數(shù)富集是該功能類型中差異表達(dá)蛋白的比例與鑒定蛋白的比例相比的折疊變化的Log2轉(zhuǎn)化值。表1 52個差異表達(dá)蛋白(DEPs)是三個組(ND, HFD, HFDS)共有的
為了揭示MSS對由高脂飲食喂養(yǎng)引起的單純性肥胖大鼠的具體作用機(jī)制，我們進(jìn)一步對五組大鼠的肝臟進(jìn)行了代謝組學(xué)分析。PCA顯示了組間和組內(nèi)的差異（圖4A）。我們在本次實(shí)驗(yàn)中共鑒定出4961個代謝物，其中正離子(POS) 2369個，負(fù)離子(NEG) 2592個，并且聚類熱圖的結(jié)果顯示各組之間不同代謝物的差異（圖4B），紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)。與HFD組相比，HFDS組有47種代謝物上調(diào)，71種代謝產(chǎn)物下調(diào)（圖4C）。這些差異代謝物的KEGG途徑分析主要涉及生物過程，如脂肪酸代謝和氨基酸代謝反應(yīng)（圖4D）。HFDS組與HFD組相比，共有9種代謝產(chǎn)物含量上調(diào)，HFD組與ND組相比，這些代謝產(chǎn)物含量下調(diào)；HFDS組與HFD組相比，共有10種代謝產(chǎn)物含量下調(diào)，HFD組與ND組相比，這些代謝產(chǎn)物含量上調(diào)(表2)。表2 三個組(ND, HFD, HFDS)共有的19個差異代謝物
圖4 使用代謝組學(xué)鑒定和分析HFD喂養(yǎng)大鼠肝臟中的差異代謝物POS表示質(zhì)譜中帶有正離子的代謝物，NEG表示質(zhì)譜中帶負(fù)離子的代謝物。（A）所有肝臟樣品的代謝物主成分分析（PCA）結(jié)果。（B）不同代謝物的聚類圖。紅色和綠色分別代表顯著的向上和向下調(diào)。（C）HFDS與HFD組的火山圖。紅點(diǎn)和綠點(diǎn)分別代表顯著上調(diào)和下調(diào)的差異代謝物。（D）不同代謝物的前20個KEGG富集途徑的氣泡圖。富因子定義為注釋到通路的差異代謝物數(shù)量除以注釋到通路中的所有已識別代謝物。52種不同蛋白質(zhì)和19種不同代謝物的數(shù)據(jù)上傳至metaboanalyst 5.0，以分析MSS對高脂飲食喂養(yǎng)大鼠肝臟的整體干預(yù)效果及其機(jī)制（圖5A、B）。我們使用Cytoscape繪制蛋白質(zhì)-代謝物相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖5C），結(jié)果表明，蛋白質(zhì)和下游代謝產(chǎn)物主要富集于PPAR信號通路、視黃醇代謝、脂肪酸b氧化、脂肪酸降解和脂肪酸生物合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、丙酮酸代謝、檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）等途徑。
（A）KEGG途徑及其影響和意義。通路影響是中心性和通路富集結(jié)果的組合，它是以客觀方式衡量中心性或“hubness”的工具。(B)差異顯著的KEGG富集途徑及其命中數(shù)。（C）差異蛋白質(zhì)和差異代謝物的蛋白質(zhì)-代謝物相互作用網(wǎng)絡(luò)，紅色表示MSS干預(yù)后上調(diào)，綠色表示下調(diào)。橢圓表示蛋白質(zhì)，矩形表示代謝物，紅色表示MSS干預(yù)后上調(diào)，綠色表示MSS干預(yù)后下調(diào)。在上述途徑中上調(diào)的蛋白質(zhì)如下：視網(wǎng)膜脫氫酶（ALDH1A）、脂肪酸結(jié)合蛋白5（FABP5）、乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶1（ACAA1）、2，4-二烯基-CoA還原酶（DECR2）、3，5-十四二烯基輔酶A異構(gòu)酶（ECH1）和peroxin-11A（PEX11A）、乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶2（ACAA2）、烯酰輔酶A水合酶（HADHA）、烯酰輔酶A氫化酶（ECHS1）。在上述途徑中被下調(diào)的蛋白質(zhì)如下：乙酰輔酶A羧化酶（ACACA）、脂肪酸合成酶（FASN）、甜菜堿同型半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶（BHMT）、甘氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PCK1）、ATP檸檬酸鹽（pro-S）裂解酶（ACLY）。在上述途徑中上調(diào)的代謝物如下：還原煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、甜菜堿和丙酮酸。在上述途徑中被下調(diào)的代謝產(chǎn)物如下：脂肪酸（亞油酸、花生四烯酸、g-亞麻酸、a-亞麻酸和十八酸）。結(jié)果提示MSS的干預(yù)可能通過上述生物反應(yīng)促進(jìn)代謝，從而改善代謝紊亂，預(yù)防高脂飲食大鼠單純性肥胖的發(fā)展。
圖6 苗酸湯改善HFD喂養(yǎng)大鼠肝臟能量代謝的示意圖橢圓表示蛋白質(zhì)，矩形表示代謝物，紅色表示MSS干預(yù)后上調(diào)，綠色表示MSS干預(yù)后下調(diào)。圖6是本研究結(jié)果的概況圖，與同時喂食MSS和高脂飼料12周的大鼠相比，喂食高脂飼料誘導(dǎo)的單純性肥胖大鼠在MSS干預(yù)后體重、空腹血糖、血脂和體脂沉積水平顯著降低，肝臟脂肪變性和脂質(zhì)沉積明顯改善(圖1,2)。我們還建立了一個NDS組，以證明MSS對正常飲食的大鼠（ND組）沒有不良健康影響。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)，在MSS半程干預(yù)后停止干預(yù)的大鼠（HFDIS組）在各項(xiàng)指標(biāo)上與HFD組的結(jié)果相似。提示MSS的持續(xù)干預(yù)顯著改善了高脂飲食引起的機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂，但可能需要繼續(xù)進(jìn)行飲食干預(yù)。蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的結(jié)果表明，MSS干預(yù)促進(jìn)了肝臟中的脂質(zhì)氧化，減少了脂質(zhì)合成，并導(dǎo)致肝臟中脂肪酸代謝消耗大量能量，從而恢復(fù)肝臟中因高脂飲食過度積累而產(chǎn)生的脂肪酸含量正常水平。同時，MSS的干預(yù)還調(diào)節(jié)了高脂飲食喂養(yǎng)大鼠的丙酮酸代謝過程和其他生物過程，進(jìn)一步改善了高脂膳食大鼠的代謝紊亂過程。脂質(zhì)在身體的生命活動中起著重要作用，直接參與細(xì)胞信號通路和基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，也是身體中重要的能量底物。膳食脂肪酸在腸內(nèi)被膽汁酸乳化成細(xì)小的微聚集體，被腸粘膜細(xì)胞吸收，包裝成腹腔顆粒，運(yùn)輸?shù)礁闻K。在肝細(xì)胞中，脂肪酸主要被運(yùn)輸?shù)骄€粒體進(jìn)行b氧化以產(chǎn)生乙酰輔酶A，它進(jìn)入檸檬酸循環(huán)，然后被完全氧化，為身體釋放大量能量。多余的脂肪酸被加工成甘油三酯或膽固醇酯，儲存在脂滴（LD）中，或形成極低密度脂蛋白（VLDL），分泌到血液中，并輸送到肝外組織中起作用。PPAR信號通路在脂質(zhì)代謝中起關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)參與脂質(zhì)氧化和代謝的下游基因，而視黃醇代謝過程與甾醇和甘油三酯代謝有關(guān)。PPAR信號通路中的FABP5是一種細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)伴侶小分子，它與疏水配體(如長鏈脂肪酸)結(jié)合，并將其運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞器(如線粒體)進(jìn)行進(jìn)一步代謝，線粒體是能量代謝的關(guān)鍵細(xì)胞器，ALDH1A1負(fù)責(zé)視黃醇代謝過程中視黃醛氧化為視黃酸，研究表明視黃酸在線粒體b氧化中起關(guān)鍵作用，其上調(diào)促進(jìn)脂質(zhì)代謝過程。脂肪酸b氧化的關(guān)鍵蛋白ACAA1、PDCR2、ECH1、Pex11a、ACAA2、HADHA和ECHS1被上調(diào)。ACAA1、PDCR2、ECH1和PEX11A是過氧化物酶體途徑中的重要蛋白質(zhì)，在脂質(zhì)代謝中起核心作用，PEX11A為過氧化物酶中的關(guān)鍵酶，其缺乏會損害過氧化物體的豐度和脂肪酸b氧化，并導(dǎo)致肝臟甘油三酯的積累。ACAA1廣泛存在于人類和動物中，并催化從游離膽固醇和長鏈脂肪酸合成酯化膽固醇。PDCR2是多不飽和脂肪酸（PUFAs）b氧化的關(guān)鍵酶，研究表明，PDCR2的敲低導(dǎo)致不飽和脂肪酸的氧化減少，從而允許脂質(zhì)積累。Ech1還參與線粒體中的脂肪酸b氧化。ECHS1、HADHA和ACAA2是脂肪酸羰基化的關(guān)鍵酶，催化十六烷基輔酶A最終轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，并且研究表明，ECHS1酶缺乏導(dǎo)致ATP產(chǎn)生受損以及脂肪酸積累，HADHA過表達(dá)減少胞質(zhì)LD形成，而ACAA2通過催化相應(yīng)b氧化途徑的最后一步參與線粒體脂肪酸的延長和降解，其過表達(dá)抑制甘油三酯的產(chǎn)生。另一方面，MSS干預(yù)降低了單純性肥胖大鼠肝臟中參與脂肪酸合成的FASN、ACACA和參與三羧酸循環(huán)的ACLY的表達(dá)。FASN是脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵酶，并使用乙酰輔酶a作為引物，丙二酰輔酶A作為雙碳供體，NADPH作為還原等價(jià)物，用于合成長鏈脂肪酸。ACACA可以催化乙酰輔酶A的羧化形成丙二酰輔酶A，是脂肪酸從頭合成的限速和關(guān)鍵調(diào)控步驟。目前認(rèn)為，抑制乙酰輔酶A羧化酶作為一種藥物開發(fā)手段可能對非酒精性脂肪肝(NAFLD)患者的治療有用。相反，三羧酸循環(huán)中的ACLY催化檸檬酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸和乙酰輔酶A，然后促進(jìn)脂肪酸、膽固醇和乙酰膽堿的合成，當(dāng)新陳代謝受到干擾時，它會異常表達(dá)。代謝組學(xué)的進(jìn)一步結(jié)果表明，肝臟中NADH的含量增加，NADH是一種關(guān)鍵的能量轉(zhuǎn)移中間體，在能量底物氧化過程中由NAD+產(chǎn)生。同時，脂肪酸含量降低，主要是亞油酸、花生四烯酸、g-亞麻酸、a-亞麻酸和硬脂酸。亞油酸是花生四烯酸的前體，可產(chǎn)生促炎二十烷酸和內(nèi)源性大麻素。g-亞麻酸可能在治療各種慢性疾病狀態(tài)中具有預(yù)防作用，富含植物源a-亞麻酸的亞麻籽油通過類固醇激素微生物群炎癥軸改善多囊卵巢綜合征，硬脂酸（FA 18:0）可以降低低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。高脂飲食導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，脂肪酸含量異常增加，在脂肪組織中誘導(dǎo)顯著的炎癥反應(yīng)，并向體內(nèi)分泌炎癥標(biāo)志物，如腫瘤壞死因子A，進(jìn)一步加重肥胖。蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的結(jié)果表明，MSS的干預(yù)促進(jìn)了大鼠肝臟中的脂質(zhì)代謝，消耗了高脂飲食帶來的過量脂肪酸氧化產(chǎn)生能量，使脂肪酸含量恢復(fù)到正常飲食水平，改善了高脂膳食引起的體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂。此外，蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果還顯示，PCK1在丙酮酸代謝，BHMT、GNMT在甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝中的表達(dá)減少。當(dāng)PCK1的過度表達(dá)導(dǎo)致葡萄糖輸出增加和糖尿病惡化，而PCK1缺失導(dǎo)致致命低血糖時，PCK1將草酰乙酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇丙酮酸，后者通過糖異生過程進(jìn)一步生成葡萄糖，是糖異生的關(guān)鍵酶，尤其是在肝臟和腎臟中。PCK1的下調(diào)可能導(dǎo)致丙酮酸的積累。丙酮酸是能量代謝過程中的關(guān)鍵物質(zhì)。在線粒體中，丙酮酸和NAD+被轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A、NADH和二氧化碳，最后通過氧化磷酸化轉(zhuǎn)化為ATP，乙酰輔酶A和草酰乙酸通過檸檬酸合成酶的作用被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，產(chǎn)生檸檬酸用于丙酮酸的再合成。BHMT和GNMT是甜菜堿代謝為甘氨酸的關(guān)鍵蛋白，下調(diào)導(dǎo)致甜菜堿水平升高。甜菜堿已被證明可以減少大鼠肝臟脂肪積累，改善胰島素抵抗，并減少肝臟脂肪變性。MSS的干預(yù)可能通過限制丙酮酸代謝過程中的關(guān)鍵酶PCK1來調(diào)節(jié)丙酮酸代謝，限制糖異生過程，同時增加肝臟中甜菜堿的量，改善高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠肝臟中的代謝。總之，本研究提示MSS干預(yù)可能通過上述生物學(xué)過程促進(jìn)單純性肥胖大鼠肝臟的脂質(zhì)代謝，通過減少脂質(zhì)沉積，調(diào)節(jié)丙酮酸代謝等生物過程，調(diào)節(jié)丙酮酸代謝等生物過程，可改善肝臟代謝紊亂，使肝臟在一定程度上恢復(fù)到正常飲食大鼠的水平。MSS是一種傳統(tǒng)食品，是貴州飲食模式的主要組成部分。它在中國貴州省黔東南地區(qū)已經(jīng)被食用了100多年。這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，MSS可能對高脂肪飲食引起的單純性肥胖有預(yù)防作用。這項(xiàng)研究的結(jié)果可能為尋找預(yù)防肥胖的新健康飲食模式提供方向和理論依據(jù)，我們將通過體外實(shí)驗(yàn)和人群調(diào)查進(jìn)一步驗(yàn)證這一點(diǎn)。https://www./articles/10.3389/fnut.2022.1019205/full
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