|
*題目中的干細胞專指間充質干細胞* 因為MSC細胞培養(yǎng)太重要，所以再發(fā)一次。 在過去的幾年中，生長因子在促進MSCs增殖和存活中的作用已經得到了廣泛的研究。大多數(shù)生長因子是多營養(yǎng)性的，導致多種生物效應。本文重點探討了常見生長因子對MSC擴增和存活的影響以及這些效應背后的分子作用機制。 MSC的一個問題是增殖，通過體外培養(yǎng)擴增過程會喪失MSC的分化、增殖和治療潛力[1, 2]。因此，為了克服MSC體外培養(yǎng)導致的快速細胞衰老問題，常常在MSC的培養(yǎng)基中添加一些生長因子，一來促進MSC的增殖，二來維持MSC在大規(guī)模增殖后的功能特性（免疫調節(jié)功能和分泌細胞因子）。下圖是各種生長因子對MSC促增值的機制圖。 MSC的第二個問題是存活，MSC輸入到體內后，在體內存活的時間比較短暫，導致不能很好地發(fā)揮治療。比如，在輸入到缺血心臟之前，用FGF-2，BMP-2和IGF-1對MSC進行預處理培養(yǎng)，顯示了存活率的提高[3]。下圖是生長因子對MSC促進存活的信號通路圖。經典生長因子在與具有內在酪氨酸激酶活性的同源受體結合后，激活幾條導致增殖的下游途徑：Ras-GTPase通過Raf和MEK到達ERK/MAPK，PI3K激活Akt/PKB，以及STAT途徑。Wnt家族關于MSC中Wnt信號的增殖有幾個相互矛盾的發(fā)現(xiàn)。典型的Wnt信號可以維持干細胞處于未分化但自我更新的狀態(tài)。通過激活典型的Wnt途徑加入Wnt3a可以增加增殖和存活，同時阻止MSC分化為成骨細胞譜系[4]。Frizzled1和Frizzled4存在于未分化的MSC上，并負責通過Wnt3a進行典型的Wnt轉導。此外，Wnt3a還能提高MSC的存活率。Wnt5a，一個非典型的Wnt，競爭與Frizzled受體結合的Wnt3a，并否定Wnt3a對MSC增殖的積極作用[5]。細胞周期進展因子cyclinD1和c-myc在這兩種信號機制中都有涉及[6]。對另一種非典型Wnt-Wnt4的研究表明，MSC增殖沒有變化[7]。另一組發(fā)現(xiàn)意味著Wnt3a啟動的典型信號傳導抑制人MSC的增殖[8]。然而，也有研究提出，低水平的典型Wnt信號促進MSC增殖，而高水平的Wnt信號抑制MSC增殖[9]。圍繞Wnt信號的部分爭議是Wnt和其他影響MSC的信號通路之間的交叉影響，比如TGF-β1以Smad3依賴的方式引起β-catenin的快速核轉位，導致增強MSC的增殖和抑制MSC成骨[10]。EGF，分子量為6-kDa，屬于比較小的一個生長因子，由血小板，巨噬細胞和成纖維細胞分泌。EGF最初是從小鼠唾液腺提取物中分離出來的，作為一種加速角膜傷口愈合的因子[11]，但很快就被認識到它確實是一種通用的生長因子，是各種類型細胞的原型有絲分裂原，對各種各樣的細胞施加各種作用，包括細胞遷移和增殖[12]。EGF對MSC的作用機制研究是目前所有生長因子中最詳盡的一個。EGF受體（EGFR/ErbB-1）是具有內在酪氨酸激酶活性的原型生長因子受體，廣泛表達于多種細胞類型，包括上皮細胞和間充質細胞譜系[13]。EGFR/ErbB-1下游的細胞內信號通路包括磷脂酶Cγ(PLCγ)及其下游鈣和蛋白激酶C介導的級聯(lián)，導致各種絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的ras激活，其他小的GTP酶如Rho和Rac，多重信號轉導和轉錄激活子(STAT)亞型，以及異源三聚體G蛋白，磷脂酰肌醇3-OH激酶(PI3K)和磷脂酶D(PLD)。在配體結合和激活后，EGFR/ErbB-1通過膜內吞系統(tǒng)從細胞表面經歷內化。人MSC表達EGFR/ErbB-1，EGF和HB-EGF（肝素結合的HGF）對MSC的促有絲分裂作用[14, 15]。人MSC不表達HB-EGF的另一種受體ErbB-4；EGF和HB-EGF都只與MSC上的EGFR/ErbB-1結合，下游信號傳導級聯(lián)相似[14, 16]。EGF不激活STAT3以促進MSC的增殖，而是強烈地刺激ERK[16]。HB-EGF是參與MSC增殖的另一個EGFR配體，表現(xiàn)為ERK1/2的激活和Akt的磷酸化，但Akt的激活明顯低于EGF。因此，隨著EGFR信號通路的激活，MSC及其早期祖細胞的總體數(shù)量將會很高，從而產生足夠的細胞用于組織形成。EGF通過EGFR/ErbB1提供下游信號通路的持續(xù)激活來阻斷EGFR/ErbB1內化并增強成骨分化，而可溶性EGF通過誘導受體內化和隨后的降解來干擾成骨分化[14, 17]。因此，來自低濃度可溶性EGF的弱信號和暫時性信號起到抑制成骨作用，而來自EGF的強持續(xù)信號作用于MSC上的促成骨信號。在EGF表面培養(yǎng)的MSC中已經觀察到ERK/MAPK通路的強烈和持續(xù)的激活[17, 18]，因此，ERK/MAPK通路可能是EGFR/ErbB-1下游主要的促成骨信號通路之一[13, 16]。但是，EGFR/ErbB-1的表達水平在人MSC制備的每個克隆中都是高度不同的，克隆之間的差異高達77倍；而且EGFR/ErbB-1水平與成骨分化能力之間沒有明顯的相關性，盡管EGFR/ErbB-1在非成骨集落中的平均水平高于成骨集落[19]。因此，很可能不僅在EGFR/ErbB-1的表達水平上存在異質性，而且在EGFR/ErbB-1的下游信號通路中也存在異質性，即使在相同的MSC制備中也是如此，這也應該導致關于EGF對MSC分化的影響的總體差異[15]。EGF能在不改變分化過程和潛能的情況下刺激MSC的增殖[16]。EGF和HB-EGF在體外都能誘導MSC的有絲分裂和運動發(fā)生反應[14, 16, 19]。EGF結合在生物材料的表面，然后MSC附著在這種結合了EGF的生物材料支架上，進行體內植入，結果發(fā)現(xiàn)結合在生物材料表面的EGF比飽和濃度的可溶性EGF更強烈地促進細胞擴散和存活，因此，構建結合EGF和MSC的生物材料支架，可以用于治療硬組織病變，例如大骨缺損[18]。另一種EGFR/ErbB1配體，即TGF-α，進一步增加了MSC的VEGF分泌，以MAPK依賴的方式上調了分泌[20, 21]。EGF處理的MSC進一步促進VEGF和HGF的分泌，但不促進bFGF的分泌[15, 22]。當細胞達到衰老時，它們的EGF受體變得下調，信號衰減高度增加，從而產生對生長因子刺激的抵抗力[23, 24]。因此，可溶性EGFR/ErbB1配體（TGF-α，EGF和HB-EGF）不僅在體外增強MSC的旁分泌和自分泌功能，而且在體內，甚至在未愈合的創(chuàng)傷組織內的炎癥微環(huán)境中也有可能增強其旁分泌和自分泌功能。轉化生長因子β（TGF-β）是一個好壞參半的因子。在組織器官的纖維化病理變化過程中，TGF-β是促進纖維化發(fā)生發(fā)展最重要的一個生長因子[25-28]。但是，TGF-β也能促進軟骨細胞增殖、細胞外基質的產生和軟骨特異性分子沉積的初始階段，同時抑制終末分化[29, 30]。當應用于體外骨髓間充質干細胞研究軟骨細胞再生時，細胞表現(xiàn)出增殖能力的增加和促進MSC向軟骨細胞分化。TGF-β家族有三個成員：TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3。這三者都能誘導MSC的增殖和軟骨細胞的形成，但TGF-β3對軟骨形成有最顯著的影響，并持續(xù)增加MSC的增殖，使其成為從植入的MSC誘導軟骨發(fā)生的主要因素[31]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2到BMP-7也屬于TGF-β超家族的成員因子。BMP-2，BMP-4，BMP-6，和BMP-7誘導MSC形成成骨細胞，BMP-2對分化的效率最強[32]。同一家族的另一成員BMP-3使MSC增殖增加三倍[33]。BMP2與TGF-β3在聯(lián)合培養(yǎng)MSC，發(fā)現(xiàn)MSC的軟骨分化明顯得到增強[34]。TGF-β或來自家族的其他因子結合一個II型絲氨酸-蘇氨酸激酶受體，然后招募另一個跨膜蛋白（受體I）。受體I磷酸化細胞內初級下游分子Smads，導致它們移位到細胞核和特定的基因轉錄。通過Smad1、Smad5、Smad8是軟骨細胞分化所必需的，而通過Smad2或Smad3的信號傳導阻斷軟骨細胞分化[35]。TGF-β也可以通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，Rho-GTP酶和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)途徑傳遞信號[36, 37]。FGF是一類參與傷口愈合和血管生成的生長因子家族。在這個家族的不同成員中，F(xiàn)GF-2或堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）常常用于MSC相關的增殖研究。FGF-2體外培養(yǎng)兔、犬和人MSC增殖增加，當以較低密度接種MSC時，其促有絲分裂作用非常明顯[38-41]。FGF-2不僅保持MSC的增殖潛能，而且通過早期的有絲分裂周期保持成骨、成脂和軟骨的分化潛能[38]。FGF-4，這個生長因子家族的另一個成員，在低密度下也能促進MSC的增殖[42]。VEGF也是MSC存活研究中廣泛使用的因子之一。發(fā)生心肌梗死并注射了MSC和VEGF肽的嚙齒動物心臟在注射部位顯示較高數(shù)量的MSC[43]。存活率的激增歸因于Akt信號的增加，導致梗死面積縮小，纖維化減輕，血管增加和心室壁增厚[44, 45]。其他細胞類型的AKT信號轉導導致原生存蛋白XIAP，Bcl2和Bcl-xL表達增加，caspase和凋亡蛋白Bad，Bax和Bim水平降低。AKT信號也抑制參與引起細胞周期阻滯和凋亡的轉錄因子FOX01，F(xiàn)OX02和FOX03[46]。VEGF培養(yǎng)MSC，可以降低了MSC長期培養(yǎng)導致的p16INK，p21和p19ARF的表達，通過增加Akt磷酸化，促進Bcl-xL表達和降低Bax的表達，提高了抗凋亡能力；與單獨注射MSCs或VEGF相比，將MSCs與VEGF共同心臟心梗后的缺血缺氧區(qū)，VEGF增加了MSC的增殖和存活，并使心功能得到更好的改善[43]。MSC本身不表達VEGF的受體，但是VEGF-A可以通過刺激PDGF受體，促進MSC的遷移和增殖[47]。低培養(yǎng)代數(shù)的MSC表達更高水平的VEGF，能更好地改善大鼠缺血再灌注導致的心臟損傷[2]。TGF-α通過p38MAPK途徑增加VEGF的產生并提高回收率[48]。對于缺血的心臟組織，迄今為止，用VEGF替代MSC是提高生存率的最佳選擇，從而改善了缺血心臟組織和分離的胰島的血管性。VEGF既可以導致MSCs更多的存活，還能對周圍的內皮細胞產生旁分泌效應，增加血管生成和形成更多的血管。目前認為血小板衍生生長因子PDGF是MSCs的非常有效的有絲分裂原（刺激細胞增殖）[49]。MSC表達PDGF-A和PDGF-C較高水平，而PDGF-B和PDGF-D較低水平，兩種受體PDGFRα和PDGFRβ也都表達[50]。這兩種受體均二聚化或異源二聚化產生重疊但截然不同的細胞信號：PDGFRαα與PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC和PDGF-AB結合；PDGFRββ與PDGF-BB和PDGF-DD結合；以及PDGFRαβ與PDGF-BB、PDGF-CC和PDGF-AB結合。PDGF-BB可以誘導MSCs的增殖和遷移[51]。雖然PDGFRβ抑制成骨，然而，已經觀察到PDGFRα誘導成骨[50]。PDGF的早期研究表明ERK信號通路的激活與MSC增殖有關[16]。雖然ERK在PDGF存在下被磷酸化，但PDGFR抑制劑的加入并不改變ERK的磷酸化水平，這可能意味著ERK激活不是通過直接PDGFR信號傳導[52]。MSC在Akt激活時增殖增加，還促進VEGF的分泌[52]。此外，在MSC中發(fā)現(xiàn)VEGF作為PDGFR的配體[52]。HGF可以激活細胞的Ras-ERK和PI3K-Akt；這些HGF對其他細胞類型激活的主要途徑[53]。抑制增殖可能是通過激活p38MAPK和阻斷G0-G1期轉變而實現(xiàn)的。這個信號還誘導通用的細胞周期進程抑制劑p21waf1和p27kip蛋白[54]。因此，HGF似乎不是與MSC一起使用的理想因子。HGF刺激MSC趨化遷移，但不能促進MSC增殖[55]。因此，HGF/c-met信號系統(tǒng)可能在組織再生的MSC募集位點中起重要作用。HGF長時間培養(yǎng)MSC，會導致MSC的細胞骨架重排、增強MSC的遷移能力，但是抑制MSC的增殖，伴隨著干細胞標記物的表達減少，比如Nucleostemin，c-kit和CD105[54]。為了實現(xiàn)MSC的培養(yǎng)擴增，目前多數(shù)采用胎牛血清（FBS）。FBS中的污染物可以導致感染，并且某些動物源成分可以觸發(fā)宿主免疫反應[56]。無血清培養(yǎng)基主要成分就是一些生長因子，擴增骨髓MSC顯示出最令人振奮的結果而且保留了這些細胞的表型、分化和集落形成潛力[57-59]。但是，無血清培養(yǎng)MSC，常常導致MSC在培養(yǎng)擴增過程中快速衰老。MSC本身也分泌各種生長因子和細胞因子，而且這些因子作為旁分泌信號，激活內源性組織細胞的復蘇和抑制免疫反應導致的炎癥[60, 61]?；贛SC的治療在很大程度上依賴于分泌各種生長因子和細胞因子的強大能力，以促進血管生成、傷口修復和組織再生[62-66]。來自老年供體和高代數(shù)MSC，被證明具有降低旁分泌活性和減少器官對移植的保護作用[2, 67]。促炎介質腫瘤壞死因子-α（TNF-α）或脂多糖（LPS）被證明可以增強骨髓間充質干細胞的旁分泌和自分泌功能[22]。VEGF和HGF都通過誘導血管生成和改善缺血組織的氧氣供應，在MSC介導的加速傷口愈合中發(fā)揮關鍵作用[62, 68-70]。生長因子是一種很有希望的MSC佐劑，可以延長MSC存活時間。PDGF、bFGF和TGF-β1的聯(lián)合應用似乎是一種很好的體外增殖替代血清的培養(yǎng)方法，抑制這些因子中的任何一個都會減緩MSC的生長[71]。然而，還需要進行更多的研究，以觀察這樣的組合是否會增強MSC存活，從而有利于傷口微環(huán)境中的細胞移植。綜上所述，正確選擇生長因子及其適當?shù)膫鬟f模式將助力MSC治療，并在不久的將來充分發(fā)揮MSC再生組織的潛力。
|
