不久前，《細胞》雜志（Cell）在線發(fā)表了一篇關(guān)于新冠抗體研發(fā)的重要論文?？茖W(xué)家們在大羊駝體內(nèi)找到了多種“納米抗體”，可在體外實驗中有效中和SARS、MERS以及新冠病毒的假病毒（pseudoviruses）。這一研究再次引起了業(yè)內(nèi)對納米抗體技術(shù)的關(guān)注。事實上，納米抗體有著巨大的應(yīng)用潛力和前景。Fierce Biotech曾將Ablynx公司的納米抗體技術(shù)平臺，評為未來十年生物技術(shù)制藥領(lǐng)域最為領(lǐng)先的十大技術(shù)平臺之首。

什么是納米抗體？簡單來說，它是一類僅含有天然存在的重鏈、尺寸比普通抗體要小得多的抗體。由于結(jié)構(gòu)獨特，納米抗體成為創(chuàng)造具有多種競爭優(yōu)勢新型生物藥物的理想材料。實際上，將納米抗體開發(fā)成藥的概念已在臨床上得到驗證，2018年全球首個納米抗體Cablivi（caplacizumab）在歐盟獲批上市。

1989年Raymond Hamers等人對單峰駱駝免疫系統(tǒng)進行了開創(chuàng)性的研究，標志著重鏈治療性抗體的發(fā)現(xiàn).7只重鏈抗體和傳統(tǒng)抗體在輕鏈上有所不同，重鏈抗體沒有可變和恒定的輕鏈以及CH1域（下圖A）。類似的重鏈抗體被發(fā)現(xiàn)在鯊魚等鯉魚中，然而，這些重鏈抗體被稱為IgNAR抗體，有5個恒定的（CH）域，并且由于在免疫鯊魚方面的困難，工程和開發(fā)具有挑戰(zhàn)性。傳統(tǒng)的抗體在重鏈和輕鏈上含有6個互補決定區(qū)（CDR），而重鏈抗體只擁有3個CDR（下圖B）。盡管只有3個CDR，但與傳統(tǒng)的6個CDR抗體相比，這些僅重鏈抗體表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合親和力和其他效應(yīng)器功能。

作為癌癥治療的納米抗體

癌癥免疫學(xué)的進展為許多新的治療策略鋪平了道路，包括抗體和納米抗體及其檢測腫瘤細胞和激活免疫系統(tǒng)效應(yīng)反應(yīng)的能力。這些突破性的癌癥免疫治療方法包括檢查點抑制的識別和治療性失活、抗原呈遞細胞（APCs）的激活、免疫抑制細胞的阻斷、免疫抑制分子的中和、嵌合抗原受體T細胞（CAR T細胞）和CAR-自然殺傷（NK）細胞的開發(fā)、細胞因子調(diào)控等。

納米抗體和T細胞在癌癥免疫治療中的應(yīng)用

目前，有三種類型的雙特異性抗體存在，具有特定的好處；雙特異性T細胞酶（BiTE）、雙親和重定向蛋白（DARTs）和串聯(lián)二抗體（TandAbs）.BiTE抗體的開發(fā)是為了將T細胞與腫瘤細胞連接起來，由兩個scFv片段組成，一個針對T細胞的抗原/標記物，如CD3，另一個針對TAA，再加上一個肽連接物。Blinatumomab是食品和藥物管理局(FDA)批準的一種BiTE，用于治療B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)，對T細胞的CD3和B細胞的CD19(在ALL中過度表達)具有特異性，與甘氨酸-絲氨酸連接體相連。這種抗體表現(xiàn)出良好的療效，但半衰期較短，這是blinatumomab以及其他BiTEs的一個主要問題，需要高治療劑量才能達到所需的T細胞活化.DARTs已被開發(fā)為一種al-ternative，以克服BiTEs的短半衰期并解決快速消除問題。與BiTEs不同的是，DARTs具有Het-erodimerized Fv片段，F(xiàn)v1片段上有靶點A的VL和靶點B的VH，F(xiàn)v2片段上有靶點B的VL和靶點A的VH48（圖2B）。

與傳統(tǒng)的BiTEs相比，穩(wěn)定性、溶解性和性能顯著提高的雙特異性納米抗體也有望呈現(xiàn)出更高的療效。最近，開發(fā)了一種針對T細胞CD3和乳腺癌細胞Her2的雙特異性抗體。這種治療方法的獨特性是結(jié)合了對Her2特異性的單域(VHH)和對CD3特異性的scFv-fragment.這種構(gòu)建體能夠很容易地在大腸桿菌中表達并通過親和層析進行純化。

cd T淋巴細胞

cd T淋巴細胞存在的數(shù)量不多，但在抗腫瘤活動中起著關(guān)鍵作用。這種小的T細胞亞群在免疫反應(yīng)中具有許多獨特的特性，它們不需要主要組織相容性com- plex（MHC）就能被激活；受應(yīng)激抗原刺激。DNAM-1(DNAX附屬分子-1)、CD27等刺激。

cd T淋巴細胞有一些子集--調(diào)節(jié)性的cdT和cdT17細胞促進腫瘤生長，而Vc9Vd2 T細胞抑制腫瘤生長，并且具有不同的activation分子和途徑，這使得它們可以被靶向治療，許多納米抗體已經(jīng)被開發(fā)出來。

NK細胞

NK細胞是先天性淋巴細胞，在抗病毒和抗腫瘤免疫反應(yīng)中具有舉足輕重的作用。它們不需要MHC的呈現(xiàn)來激活，通過許多受體，如CD94/NKG2A、KIR、天然細胞毒性受體NKp46、NKp30、NKp44、IgG受體FccRIII和許多其他C型凝集素樣受體，利用激活和抑制（殺傷和不殺傷）信號已經(jīng)開發(fā)了大量的納米體構(gòu)建物來靶向NK細胞的FccRIII（CD16）。在駱駝中生成了兩個針對FccRIII胞外域的駱駝納米抗體（C21和C28），對FccRIIIb+聚嗎啡有顯著親和力。

納米抗體-藥物共軛物

將納米抗體等靶向治療與化療/放療等非靶向治療相結(jié)合，是對以往方法的一種進步?？蒲腥藛T將一個VHH7域(針對MHC類-II)作為治療劑，同時也是B細胞淋巴瘤的想象工具.當(dāng)VHH7域與含硫代梅坦辛衍生物默坦辛(DM1)共軛并作為治療劑使用時，在A20 B細胞淋巴瘤的小鼠模型中表現(xiàn)出極好的特異性、內(nèi)化性和細胞毒性，它導(dǎo)致腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的減少(圖2F)。同樣的VHH7域，當(dāng)與近紅外（NIR）熒光團結(jié)合時，在可視化局部和轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞方面表現(xiàn)出優(yōu)異的診斷性能同樣，作為新的靶向構(gòu)建體，靶向放射性核素治療與納米抗體的結(jié)合正在獲得巨大的關(guān)注。

納米體酶結(jié)合物是另一種納米體-酶結(jié)合物為基礎(chǔ)的方法，在消除腫瘤方面表現(xiàn)出了良好的活性。2004年有科學(xué)家開發(fā)了一種納米體酶結(jié)合物，cAb-CEA5:bL來靶向腫瘤相關(guān)的CEA114(圖2G)。該納米體與Enterobacter cloacae b-lactamase酶共軛，該酶可特異性地激活抗腫瘤原藥7-(4 carboxybutanamido cephalosporin mustard)，使其成為活性藥物苯二胺芥。共軛使用llama c2c鉸鏈進行，以提供靈活性和穩(wěn)定性，并顯示出從系統(tǒng)循環(huán)中快速清除和在腫瘤中的濃度，從而避免脫靶毒性。

基于納米抗體的CAR T細胞治療

2018年首次推出基于納米抗體的CAR T細胞療法，以VHH域針對MUC-1和CD28和OX40為共刺激分子，在腫瘤異種移植中觀察到該CAR T細胞對MUC-1+腫瘤細胞的殺傷作用，并結(jié)合促炎細胞因子IL-17和IFN-的產(chǎn)生增加。

這個NanoCAR系統(tǒng)被進一步增強了一個自殺基因系統(tǒng)，以避免對健康細胞造成不必要的損害，并控制不必要的復(fù)制。在這個系統(tǒng)中，一個使用了同二聚體調(diào)控的caspase 8，該caspase 8被合成配體AP20187激活，以誘導(dǎo)apo-ptosis。

除了腫瘤微環(huán)境外，治療實體瘤的一個重大挑戰(zhàn)是腫瘤特異性靶點識別。為了解決這個問題，麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)的研究人員開發(fā)了基于納米體的CAR T細胞，其靶向是一般的腫瘤微環(huán)境，特別是存在于多種腫瘤類型上的PD-L1和EIIIB.這些納米CAR T細胞療法在許多腫瘤中表現(xiàn)出了很好的識別和結(jié)合活性，當(dāng)激活時還能分泌IL-2和IL-12，這增加了腫瘤的炎癥。

基于雙特異性納米體的Car T細胞療法也已經(jīng)被開發(fā)出來，因為依靠單一抗原進行腫瘤識別通常是不夠的，并導(dǎo)致抗原陰性腫瘤的治療失敗。2018年科學(xué)家開發(fā)了兩種針對CD20和HER2的NanoCAR；抗原結(jié)合域由兩個VHH串聯(lián)域組成，針對腫瘤細胞上兩種不同的抗原，這種NanoCar方法通過克服腫瘤上抗原丟失的問題，在消除腫瘤方面表現(xiàn)出了良好的潛力。此外，還開發(fā)了一種基于納米體的抗EGFR+腫瘤的UniCAR。與傳統(tǒng)CAR不同的是，這種UniCAR的活性可以通過重組靶向模塊表位進行調(diào)控并靶向腫瘤特異性抗原，從而消除了細胞因子綜合征和CAR T細胞過度外顯等不必要的風(fēng)險。這種基于納米抗體的UniCAR顯示出可控的、實質(zhì)性的腫瘤細胞溶解和良好的生物分布，并具有較長的半衰期。一些在臨床前開發(fā)中的納米抗體列在下表中。

結(jié)論

納米抗體具有良好的動態(tài)特性、契約大小、熱穩(wěn)定性、穿透能力（甚至可以穿過BBB）、高溶解度和低免疫原性，使其成為非常有前景的治療分子。易操作和低成本的生產(chǎn)進一步增加了它們作為治療藥物的前景。它們通過激活效應(yīng)細胞和抑制免疫抑制的幾種動態(tài)策略，被用于治療多種疾病，特別是癌癥。缺少VL-VH域的雙特異性納米抗體表現(xiàn)出令人印象深刻的穩(wěn)定性，聚合度極低。許多裸露的拮抗性納米體構(gòu)建體通過阻斷離子通道、生長因子受體，顯示出對腫瘤發(fā)生途徑的成功滅活。它們的微小尺寸顯示了納米抗體和納米抗體-藥物共軛物的可重復(fù)標記的組織滲透和生物分布，這為對抗實體瘤打開了大門，增強了療效。納米抗體在光熱治療和光動力治療中的應(yīng)用具有良好的抗腫瘤反應(yīng)。合成生物學(xué)的進展導(dǎo)致了益生菌的發(fā)展，益生菌能夠在腫瘤微環(huán)境中合成治療性的抗腫瘤納米抗體，以避免與conven- tional檢查點抑制劑的毒性挑戰(zhàn)。以納米抗體為可變域的CAR T和CAR NK細胞，開發(fā)出了具有優(yōu)異抗腫瘤活性和腫瘤特異性的雙特異性CAR T和CAR NK細胞。它們的潛力吸引了許多制藥公司的興趣，目前納米抗體已成為許多藥物管線中的主要產(chǎn)品。最近FDA批準了CABLIVI納米體用于治療血栓性血小板減少性紫癜，進一步高光了它們在市場上的出現(xiàn)，它們無疑將繼續(xù)革新治療方案。