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2021精選二十大生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熱門行研報告
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如果想知道之所以每個人都是獨一無二個體的原因，首先，就要獲得構(gòu)成人類的 “遺傳密碼”（DNA），也就是四種堿基A、G、C、T排列順序；其次就是找到“破譯本”——從DNA到蛋白的基因表達圖譜。這樣的破譯過程已經(jīng)可以通過基因組測序及一系列相關(guān)的技術(shù)實現(xiàn)。 《Nature》雜志上發(fā)表了一系列文章，濃墨重彩地描述了“基因測序20年的各個里程碑”，主要介紹在過去的20年中，那些令人激動的基因測序相關(guān)技術(shù)的發(fā)展史，以及不斷擴大的科學(xué)與社會應(yīng)用。圖1 基因序列是指組成DNA的四種堿基A、G、C、T排列順序基因測序技術(shù)的巨大潛力從誕生就被科學(xué)界迅速認可，之后成為了生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中最具影響力的工具之一。1997發(fā)明了Walter Gilbert測序法和Sanger測序法。僅僅3年之后，1980年諾貝爾化學(xué)獎就被授予了Walter Gilbert和Frederick Sanger。而到80年代末，自動化Sanger測序儀已經(jīng)可以實現(xiàn)每天1000個序列的基因測序。在測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展推動下，90年代科學(xué)家們首次實現(xiàn)了對特定細菌、單細胞和多細胞真核生物的全基因組測序。從被發(fā)明到20世紀(jì)初，Sanger測序法在很長一段時間內(nèi)都是基因測序的主流技術(shù)。利用此方法科學(xué)家取得了非常耀眼的成績——包括測得了人類基因組全序列和表達譜的“人類基因組計劃”。我們選擇了“人類基因組計劃”作為“基因測序20年里程碑系列”的開篇。在高通量、并行化的第二代測序技術(shù)（Sanger測序法被稱為第一代測序技術(shù)）被發(fā)明并實現(xiàn)商業(yè)化之后（里程碑2），基因測序技術(shù)被逐漸普及到更多的實驗室和企業(yè)中，并正式步入了騰飛時代。在此系列中，測序技術(shù)和信息技術(shù)共同推動了一些關(guān)鍵應(yīng)用研究項目的落地實施。回望過去，我們也認識到科學(xué)是人類團結(jié)合作的成果。每一個突出的里程碑式成果都是建立在如山如海般的前人努力之上。技術(shù)的突破和科學(xué)的發(fā)展與應(yīng)用也是相輔相成的。感謝所有對基因測序技術(shù)做出貢獻的科學(xué)工作者們。新世紀(jì)基因測序技術(shù)20年大事件年表2001年，人類基因組序列草圖首次發(fā)布(里程碑1)2001年人類基因組草圖的發(fā)布是一項具有里程碑意義的成就?？茖W(xué)家們第一次可以逐個堿基地研究每個人類染色體鏈。研究人員便可以開始理解各個基因的排序方式，以及周圍非蛋白質(zhì)編碼DNA的結(jié)構(gòu)和組織方式。盡管取得了令人驚奇的進步，但基因組草圖仍然不完整，缺少了1.5億個堿基。在過去的幾年中，技術(shù)的進步使研究人員得以加入到基因組草圖中，并最終在2020年完成對染色體的完全測序。
2004年，宏基因組學(xué)的誕生(里程碑2)傳統(tǒng)微生物的研究通常需要通過培養(yǎng)來分離單個菌株。然而，微生物學(xué)家很早就發(fā)現(xiàn)，很多種自然界中存在的微生物無法在實驗室中培養(yǎng)，這意味著，使用培養(yǎng)的研究策略，只能夠捕捉到自然界中微生物多樣性的1%，那么用什么手段才能夠研究那剩余的99%？在2004年，兩項劃時代的研究通過對環(huán)境中采集的包含多種不同微生物的樣本進行測序，成功構(gòu)建了樣本中包含的不同微生物的基因組序列。這兩項研究表明，不用單獨分離和培養(yǎng)一種微生物，就可以通過DNA測序技術(shù)，對復(fù)雜微生物群體中不同微生物進行分類，并且發(fā)現(xiàn)未知的微生物。它們揭示了宏基因組學(xué)（metagenomics）的巨大潛力。 2005年，新一代基因測序技術(shù)(里程碑3)新一代測序技術(shù)應(yīng)運而生。454公司于2005年推出Genome Sequencer 20 System，這是第一個基于焦磷酸測序原理的高通量基因組測序系統(tǒng)，這也是核酸測序技術(shù)發(fā)展史上里程碑式的事件。以2005年454技術(shù)發(fā)布為標(biāo)志，新一代測序技術(shù)開始登上舞臺。
目前，數(shù)千臺新一代測序儀分布在全球逾百家科研機構(gòu)與公司，被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)等各個領(lǐng)域的科研、教學(xué)與應(yīng)用中。 2007年，結(jié)合位點分析法（ChIP-seq）—從基因到蛋白質(zhì)的研究方法(里程碑4)染色質(zhì)免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation ，ChIP）技術(shù)誕生很早，由Orlando等人創(chuàng)立于1997年，發(fā)表于2000年，先利用Microarray技術(shù) ChIP-chip，后2007年利用DNA sequencing技術(shù) ChIP-seq。ChIP-seq的目的是研究感興趣蛋白在基因組上的結(jié)合位點，可以用來鑒定轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor, TF）的結(jié)合位點或者轉(zhuǎn)錄后更廣范圍的組蛋白修飾（histone marks），一般與調(diào)控元件有關(guān)。
2008年，一種新的測序方法被應(yīng)用于人類基因組測序(里程碑5)2008年，在《自然》雜志上發(fā)表的兩篇論文使用下一代基因測序技術(shù)（NGS），生成了一名非裔個體和一名亞裔個體的基因組。在這兩項研究中，研究人員使用了稱為Solexa測序的下一代測序技術(shù)。而在2001年發(fā)布的第一版人類基因組圖譜耗資3億美元，耗時十幾年。而使用下一代測序技術(shù)，在2008年可以在幾周內(nèi)完成對一個人類基因組的測序，將測序成本降低到50萬美元。2008年，癌癥相關(guān)的基因測序揭示了基因突變與癌癥的相關(guān)性(里程碑6)；2008年，人類發(fā)布了首個急性髓系白血病（AML）樣本的全基因組序列。在這項研究中，對一名50多歲的AML患者的腫瘤細胞和正常皮膚細胞樣本進行了全基因組測序。科學(xué)家使用下一代測序技術(shù)，通過將癌細胞的基因組序列和正常細胞的基因組序列進行比較，研究人員發(fā)現(xiàn)了在癌細胞中的8個全新基因突變。2008年，從基因短序列到整個基因組的重建—基因組裝配技術(shù)的發(fā)展(里程碑7)基因組蘊藏著生命的奧秘，人類自從發(fā)現(xiàn)DNA，發(fā)明DNA測序手段，就在孜孜不倦的破譯各種生物的基因組。一個完整的、精確的參考基因組能夠為人類疾病研究、動植物遺傳育種研究等方面打下堅實的基礎(chǔ)。Contig N50可以作為基因組組裝結(jié)果好壞的一個最直接的評判標(biāo)準(zhǔn)。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，基因組組裝最明顯的變化是Contig N50指標(biāo)的提升。在二代測序組裝時代，Contig N50一般幾kb-幾百kb，三代測序技術(shù)的發(fā)展，使其提升到數(shù)Mb乃至上百Mb的水平。2009年，長序列基因測序技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展(里程碑8)理想的測序方法應(yīng)該是對原始DNA模板進行直接、準(zhǔn)確的測序，并且不受讀長限制。早在20世紀(jì)80年代，研究人員就開始為了實現(xiàn)這個目標(biāo)而努力，隨著納米、芯片、精密加工、光學(xué)電子、酶工程等技術(shù)的有效發(fā)展，以不經(jīng)擴增的單分子、長讀長的新一代測序逐漸走進大眾視線。2009年，全外顯子組測序被首次應(yīng)用于單基因疾病(里程碑9)簡單來說，外顯子組就是遺傳代碼中蛋白質(zhì)編碼的組分，占整個基因組的1%-2%。測序儀每跑一次僅能讀取一定數(shù)量的堿基，但通過測序外顯子組，研究人員能更快地生成更多的堿基。與全基因組相比，它也可以用更低的成本做出更好的分辨率。2009年，第一次應(yīng)用外顯子組測序在Freeman-Sheldon綜合征患者中發(fā)現(xiàn)致病基因MYH3突變。2009年，高通量測序為基礎(chǔ)的染色質(zhì)構(gòu)想捕捉技術(shù)（Hi-C）揭示了基因組的三維架構(gòu)(里程碑10)隨著高通量測序的發(fā)展，我們對于生物的基因組序列及其上的功能元件都有了比較深入的了解。人類的基因組一共只有23對染色體，卻由總共30億個堿基對串聯(lián)而成，如此長的DNA必然要經(jīng)過層層折疊才能塞到細胞核中，然而我們對于基因組的高維結(jié)構(gòu)卻知之甚少?；蚪M并不是散亂地分布在細胞核中，而是有序地層層折疊，這使得線性距離非常遠的DNA片段可能在空間上相互作用。高維基因組的研究目前最成熟的技術(shù)則是染色質(zhì)構(gòu)象捕獲(Chromosome conformation capture, 簡稱3C)及其衍生技術(shù)，2009年，由3C技術(shù)的發(fā)明人Dekker教授課題組提出了3C的高通量版本Hi-C，于是才有了成熟的全基因組范圍的染色質(zhì)互作分析方法，同時也為染色體高維結(jié)構(gòu)的分析提供了可能。2009年，單細胞測序技術(shù)提供了增加了細胞異質(zhì)性研究的新視角(里程碑11)基于對組織樣本的基因表達檢測只能夠發(fā)現(xiàn)不同細胞類型產(chǎn)生的平均結(jié)果，這可能導(dǎo)致研究人員忽略特定細胞類型的表現(xiàn)。單細胞測序（Single-cell sequencing）是指獲取單個細胞遺傳信息的測序技術(shù)，即對單個細胞水平上，對基因組或轉(zhuǎn)錄組進行提取擴增和高通量測序分析，在2009年，Nature Methods發(fā)布了首個對單個小鼠卵裂球（blastomere）進行的全轉(zhuǎn)錄子組研究。2010年，古代DNA測序技術(shù)及應(yīng)用(里程碑12)由于傳統(tǒng)PCR技術(shù)很難正確擴增含量極低的內(nèi)源DNA片段，導(dǎo)致部分古DNA實驗結(jié)果不可重復(fù)，所以針對人類的古DNA研究方法在該階段依舊受到極大的質(zhì)疑，隨著二代測序技術(shù)的誕生，古DNA研究迎來了高速發(fā)展的時代。由于二代測序技術(shù)能夠得到極短的DNA片段信息（這與古DNA的特征相似），所以實驗人員可以進行測序，并通過生物信息技術(shù)進行拼接，來獲得可靠的古DNA數(shù)據(jù)。實驗方法也在這一階段不斷被革新，2010年拉斯馬森（M. Rasmussen）等報道了4000多年前的愛斯基摩人基因組，格林（R. E. Green）等依據(jù)3個尼安德特人樣品繪制了尼安德特人的基因組草圖。隨后，越來越多的古人類基因組被公布出來，如丹尼索瓦人、早期現(xiàn)代人（包括田園洞人、Ust'-Ishim和Oase1）等，研究也逐漸深入化和多元化。這些研究共同推動了古人類DNA研究不斷前進，為古人類遷徙路線及人群間基因交流的探索提供了遺傳學(xué)支持。 2012年，通過大規(guī)模的基因測序?qū)θ祟愡z傳變異進行編碼研究(里程碑13)人類基因組計劃（Human Genome Project, HGP）是科學(xué)家揭秘人類基因組圖譜、為人類遺傳以及相關(guān)疾病的研究提供了先驅(qū)力量以及藍圖的里程碑式工作，被譽為生命科學(xué)的“登月計劃”。人類基因組既包括蛋白質(zhì)編碼基因，也包括控制這些基因何時表達以及表達到何種程度的調(diào)控信息。雖然人類大多擁有相同的基因和調(diào)控元件，但潛在的基因序列和地球上的人一樣多樣化，每個個體的基因組都是獨一無二的。2012年，DNA元件百科全書（ENCODE）構(gòu)建人類基因組全面的功能元件清單，包括在蛋白質(zhì)和RNA水平上起作用的元件，以及控制基因活躍的細胞和環(huán)境的調(diào)控元件(里程碑14)在2003年，名為DNA元件百科全書（Encyclopedia of DNA Elements, ENCODE）的研究項目開始啟動。在2012年，這一項目的第二階段（ENCODE 2）完成，研究團隊在《自然》，Genome Research和Genome Biolgoy上發(fā)表了30篇論文。他們不但確認了20687個編碼蛋白的基因，而且在147種不同的細胞類型中描繪了它們的表達模式。研究人員還發(fā)現(xiàn)了超過7萬個啟動子和接近40萬個增強子區(qū)域，為基因組中接近80%的序列找到了至少一種功能。 2014年，泛基因組捕獲一個物種的許多代表的遺傳變異(里程碑15)泛基因組包括了一個物種所含有的核心基因組（Core genome）和非必須基因組（Dispensable genome）。其中，核心基因組由所有樣本中都存在的序列組成，一般與物種生物學(xué)功能和主要表型特征相關(guān)，反映了物種的穩(wěn)定性；非必須基因組由僅在單個樣本或部分樣本中存在的序列組成，一般與物種對特定環(huán)境的適應(yīng)性或特有的生物學(xué)特征相關(guān)，反映了物種的特性。泛基因組（Pan-genomes）的開發(fā)可以更全面的捕獲物種基因庫中包含的基因組變異信息，有利于物種育種及相關(guān)研究的進行。 
2017年，多種測序技術(shù)結(jié)合得到完整基因組序列(里程碑16)人類基因組圖譜的最新版本于2013年發(fā)布，被稱為GRCh38。從那時起，它就被反復(fù)修補。至今，它仍然缺少5%-10%的基因組，包括所有的著絲粒和其他困難區(qū)域，如編碼核糖體RNA序列的大量基因。這些缺失的基因組藏于大量重復(fù)基因拷貝的長序列中。兩種長讀長測序技術(shù)正在填補這些缺口。加州生物技術(shù)公司太平洋生物科學(xué)（Pacific Biosciences，以下簡稱PacBio）使用一種成像系統(tǒng)來直接讀取數(shù)十萬甚至數(shù)百萬條平行DNA鏈，每條鏈包含數(shù)千個堿基。另一種技術(shù)是由英國公司牛津納米孔技術(shù)（Oxford Nanopore Technologies）實現(xiàn)商業(yè)化，它將DNA鏈穿過微小的蛋白孔或納米孔，測量核苷酸穿過孔道時電流的細微變化，進而讀取數(shù)萬至數(shù)十萬個堿基。2020年，人類染色體首次無間隙得以端粒對端粒的方式進行組裝(里程碑17)整整20年前，2001年，人類基因組工作草圖發(fā)布。這是人類基因組計劃的重要里程碑之一，也是我們了解人類基因組的關(guān)鍵時刻，它為我們對人類生物學(xué)和疾病基因組基礎(chǔ)的理解鋪平了道路。自此，我們邁入了基因組學(xué)的時代。 但是，當(dāng)時科學(xué)家的任務(wù)還沒有結(jié)束：還有一部分基因組沒有被測序，也存在一些序列信息可能不準(zhǔn)確的問題。技術(shù)限制意味著，人類基因組序列的原始草圖只涵蓋了基因組“常染色質(zhì)”的部分。人類基因組中有約92%為常染色質(zhì)，大多數(shù)基因都是在這里發(fā)現(xiàn)的，是制造RNA和蛋白質(zhì)等基因產(chǎn)物最為活躍的部分。到2013年，基因組參考聯(lián)盟（GRC）發(fā)布了更新的人類參考基因組GRCh38。盡管經(jīng)過數(shù)十年的努力，它已經(jīng)是迄今為止最精確和完整的脊椎動物基因組之一，但它仍不是一個“一字不差”的完整基因組，大約還差8%的序列尚未被測序。 直到2020年，遺傳學(xué)家Karen Miga帶領(lǐng)團隊借助新的技術(shù)和方法，首次成功挑戰(zhàn)了對人類X染色體的“從頭到尾”（從端粒到端粒）的完整測序，其中不存在任何缺口，其精確度達到了前所未有的水平。
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