【原】宏基因組分析專題（5）：從宏基因組數(shù)據(jù)中得到高質(zhì)量的基因組數(shù)據(jù)- MetaBAT的安裝和使用

微生態(tài) 2021-09-04

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寫在前面

宏基因組分箱（Binning）是將宏基因組測(cè)序得到的混合了不同微生物的序列reads或序列組裝得到的contigs或scaffolds按物種分開歸類的過(guò)程。這些分開歸類的序列被稱為宏基因組組裝基因組（metagenome-assembled genomes，MAGs)。

在宏基因組分析中，往往需要在宏基因組數(shù)據(jù)中重建某個(gè)單個(gè)的生物的基因組來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步研究，其中代表性的分箱工具為Maxbin和MetaBAT。一般來(lái)說(shuō)宏基因組分箱的基本原理是通過(guò)四核苷酸頻率（tetranucleotide frequency），GC含量和必需的單拷貝基因等的不同來(lái)區(qū)分不同的基因組。具體的算法參照以下網(wǎng)址：MetaBAT（https:///articles/7359/），Maxbin（https://academic./bioinformatics/article-abstract/32/4/605/1744462）。

兩款軟件都是宏基因組分箱權(quán)威軟件，本文將重點(diǎn)介紹MetaBAT的安裝和使用。下圖為MetaBAT的pepline，首先將不同來(lái)源的基因組，在二代測(cè)序后并進(jìn)行組裝，將測(cè)序的reads比對(duì)到組裝的contigs上，通過(guò)MetaBAT軟件計(jì)算contig的四核苷酸頻率（TDP），計(jì)算所有樣本的豐度距離概率 (ADP)，組合每個(gè)contigs的TDP和ADP，對(duì)這些contigs結(jié)果距離形成一個(gè)距離矩陣，通過(guò)在距離矩陣中迭代和窮舉來(lái)得到每一個(gè)bin。MetaBAT2 在MetaBAT的基礎(chǔ)上使用了全新的算法，提高了分箱的準(zhǔn)確度。

圖1

安裝和使用

一、MetaBAT的安裝和使用

參考官方文檔：

https:///berkeleylab/metabat/issues?status=new&status=open

1.1 安裝前準(zhǔn)備

要保證自己的linux系統(tǒng)相關(guān)的軟件版本達(dá)到安裝要求

gcc/g++ >= 4.9

boost >= 1.53

cmake >= 3.8.2

make >= 4.1

可以輸入conda update –all 升級(jí)所有的軟件包。

1.2 開始安裝

git clone https:///berkeleylab/metabat.git #下載安裝包

cd metabat

mkdir build

cd build

cmake -DCMAKE_INSTALL_PREFIX=$HOME/metabat ..

make #編譯

make install

cd ..

rm -rf build

1.3 報(bào)錯(cuò)解決

筆者在軟件編譯 (make) 這一步的時(shí)候出現(xiàn)了這樣一個(gè)報(bào)錯(cuò)

圖2

可以看到報(bào)錯(cuò)信息為antoheader沒(méi)有找到，解決方法如下：

sudo apt-get install autoconf

我們?cè)诮鉀Q安裝報(bào)錯(cuò)的時(shí)候一定要認(rèn)真看系統(tǒng)反饋的報(bào)錯(cuò)信息才能更好的解決，當(dāng)編譯到100%的時(shí)候及編譯成功。

圖3

1.4 將MetaBAT加入到環(huán)境變量中

當(dāng)安裝成功時(shí)候，首先得把軟件加入到環(huán)境變量中

export PATH=$PATH:$pwd #把當(dāng)前目錄加到環(huán)境變量中這只是臨時(shí)的生效，永久生效請(qǐng)修改bashrc文件

二、運(yùn)行MetaBAT

2.1 數(shù)據(jù)準(zhǔn)備

使用SRR1976948_1.fastq.gz，SRR1976948_2.fastq.gz 以及在上節(jié)通過(guò)megahit拼接的contig.fa文件

ln -s /mnt/f/微生態(tài)/*.gz #把文件軟鏈接到我的當(dāng)前工作文件夾

2.2 依賴軟件安裝

MetaBAT的運(yùn)行依賴bowtie2 Samtools 等軟件

conda Install bowtie2

conda install samtools

2.3 使用bowtie建立索引文件

bowtie2-build -f contigs.fa contig --threads 2

2.4 建立比對(duì)

bowtie2 -1 SRR1976948_1.fastq.gz -2 SRR1976948_2.fastq.gz -p 2 -x

final -S contig.sam

2.5 將sam文件轉(zhuǎn)換成bam文件

samtools view -@ 2 -b -S contig.sam -o contig.bam

2.6 對(duì)bam文件進(jìn)行排序

samtools sort -@ 2 -l 9 -O BAM contig.bam -o contig.sorted.bam

2.7 計(jì)算contig的深度

jgi_summarize_bam_contig_depths --outputDepth contig.depth.txt contig.sorted.bam

2.8 開始分箱

metabat2 -m 1500 -t 2 -i contigs.fa -a contig.depth.txt -o all -v

三、在線的宏基因組分析網(wǎng)站

由于MetaBAT運(yùn)行時(shí)間比較長(zhǎng)，且筆者的筆記本電腦性能太差了，因此筆者這里就不展示用虛擬機(jī)跑出來(lái)的結(jié)果了，這里可以再安利兩個(gè)在線的可以做宏基因組分析的網(wǎng)站：一個(gè)是國(guó)內(nèi)的國(guó)家微生物科學(xué)中心（https://，圖4），另一個(gè)是國(guó)外的Kbase網(wǎng)站（https://narrative./，圖5）。在這兩個(gè)網(wǎng)站注冊(cè)后就可以進(jìn)行宏基因組一些基本的分析，對(duì)沒(méi)有Linux基礎(chǔ)的和沒(méi)有服務(wù)器的同學(xué)可以做一些簡(jiǎn)單的分析。

圖4

圖5

3.1 在kbase上進(jìn)行宏基因組分析

下面來(lái)簡(jiǎn)單介紹下kbase里面的Metabat的使用。Kbase的使用非常簡(jiǎn)單，找到MetaBAT2后有三個(gè)需要填寫的選項(xiàng)，第一個(gè)選擇你組裝的contigs，第二個(gè)選擇你的原始測(cè)序的fastq文件，第三個(gè)填寫下輸出文件的名稱，點(diǎn)擊左上角的run即可運(yùn)行。

圖6

這是通過(guò)kbase網(wǎng)站得到的結(jié)果可以看到共分出8個(gè)bins

圖7

四、寫在最后

在本節(jié)中，通過(guò)MetaBAT對(duì)宏基因組進(jìn)行了分箱操作，雖然得到了很多了bins，但是這些分箱得到的bins的質(zhì)量還是未知的。在下一節(jié)中將會(huì)介紹使用CheckM對(duì)宏基因組分箱的bins進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。

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