文章信息

文獻(xiàn)標(biāo)題：SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation
發(fā)表時間：2018.10.22
發(fā)表雜志：Genome Biology（IF=10.806）
原文鏈接：https://genomebiology./articles/10.1186/s13059-018-1547-5

摘要

在一些重要的生物學(xué)問題中，需要對單細(xì)胞中的蛋白組數(shù)據(jù)進行定量分析。這篇文章中，作者提出了根據(jù)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)對人類腫瘤細(xì)胞類型進行識別的方法——SCoPE-MS ，并在小鼠正在分化的胚胎干細(xì)胞中定量了超過一千種蛋白質(zhì)。單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)提出了利用蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)對細(xì)胞類型定義的新方法，并能推斷細(xì)胞類型與特定的蛋白質(zhì)豐度之間的潛在關(guān)系。單細(xì)胞蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組之間的對比分析表明，mRNA和蛋白質(zhì)水平之間存在共變關(guān)系，而許多基因能在mRNA和蛋白質(zhì)水平發(fā)揮協(xié)同調(diào)控作用。

背景介紹

建立在細(xì)胞層面的差異分析，是理解人體正常生理活動，解決腫瘤免疫、干細(xì)胞療法等問題的關(guān)鍵，這需要對單細(xì)胞蛋白質(zhì)組進行量化分析。然而，過去對哺乳動物單細(xì)胞蛋白質(zhì)的定量方法停留在免疫成像和測定抗體蛋白這兩種研究方法。免疫熒光成像技術(shù)有效，但只限于對細(xì)胞中的一些蛋白質(zhì)進行定量，并會在圖像中產(chǎn)生偽影。建立在抗體蛋白上的檢測方法在近幾年有了很大的突破和發(fā)展，但仍然存在一些技術(shù)方面的缺陷。

另一方面，作者提到了應(yīng)用液相色譜法 (liquid chromatography) 和串聯(lián)質(zhì)譜法(tandem mass spectrometry)能在bulk樣本中對幾千種蛋白質(zhì)進行定量，并推斷這種方法沿用在單細(xì)胞中對蛋白質(zhì)進行定量的合理性。作者發(fā)現(xiàn)每個細(xì)胞中主要蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)超過50000，而現(xiàn)在的質(zhì)譜分析儀器能夠?qū)Ψ肿拥纳习賯€拷貝數(shù)進行定量。因此，只要能夠從單細(xì)胞中得到1%的蛋白質(zhì)拷貝進行質(zhì)譜分析，便能進行精準(zhǔn)的定量。

SCoPE-MS的技術(shù)方法

首先，作者提出SCoPE-MS需要解決兩個重要的技術(shù)問題：

• 1）在對單細(xì)胞中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到用于質(zhì)譜分析的載體過程中，如何最小化提取過程中蛋白質(zhì)的損失？

• 2）如何實現(xiàn)同時對單細(xì)胞樣本中的肽分子進行識別和定量？

對于第一個問題，作者利用人工方法在顯微鏡下分離存活的單細(xì)胞，并通過聲波的方法將細(xì)胞進行裂解(圖a)。過去使用化學(xué)方法對細(xì)胞進行裂解，需要對使用的化學(xué)藥劑進行清除，而這種方法會間接造成單細(xì)胞中蛋白質(zhì)的損失。然后，從細(xì)胞的裂解產(chǎn)物中提取的蛋白質(zhì)在90度時快速變性，并在45度中利用胰酶進行消化。同時，SCoPE-MS通過構(gòu)建載體細(xì)胞的形式運輸?shù)鞍?。載體細(xì)胞能夠有效減少由于蛋白質(zhì)表面的黏附作用造成的蛋白質(zhì)流失。

對于第二個問題，作者采取的方法是串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(TMT)進行定量蛋白分析。這項技術(shù)可以對一次實驗中多個樣本進行全蛋白組定量分析。在單細(xì)胞層面，TMT能夠通過標(biāo)記每個樣本中的肽段后對肽段進行識別和定量。

對于TMT標(biāo)記肽段的定量依賴于報告離子(reporter ion, RI)，RI的表達(dá)水平能夠反映肽段的豐度和噪聲的分布。作者通過計算信噪比，得出RI的強度在非空閑的信道中與標(biāo)記的肽段數(shù)量成比例，而在空閑的信道中強度普遍較低的結(jié)論。

為了檢驗和評估SCoPE-MS的功能，作者通過將SCoPE-MS定量單細(xì)胞蛋白質(zhì)的方法和bulk樣本定量蛋白的方法進行對照分析(圖b-e)。結(jié)果表明，SCoPE-MS盡管含有更多噪聲，但定量結(jié)果的精確度和重現(xiàn)度更高。

應(yīng)用SCoPE-MS研究分化中的胚胎干細(xì)胞

作者通過SCoPE-MS這種方法，對小鼠的胚胎干細(xì)胞在分化過程中的單細(xì)胞層面的蛋白質(zhì)表達(dá)的異質(zhì)性和動態(tài)變化進行了量化分析(圖a-d)。作者從胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)液去除白細(xì)胞抑制因子(LIF), 并進行懸浮培養(yǎng)。圖a反映的是在去除LIF后3、5、7天的細(xì)胞中根據(jù)蛋白質(zhì)表達(dá)計算協(xié)方差相關(guān)系數(shù)并進行層次聚類的結(jié)果，揭示了胚胎干細(xì)胞各分化階段的每個group之間的蛋白質(zhì)表達(dá)關(guān)聯(lián)度的差異。圖a中三張圖的每一行或者每一列為一種蛋白質(zhì)關(guān)于所有蛋白質(zhì)的關(guān)聯(lián)向量。然后，作者分別對day3、day5、day8兩兩進行關(guān)聯(lián)向量的關(guān)聯(lián)度分析，圖b反映了day5和day8之間的關(guān)聯(lián)向量的平均關(guān)聯(lián)度最高，說明day5和day8之間的蛋白質(zhì)的關(guān)聯(lián)向量的情況更加相似。

圖c是對細(xì)胞中的核糖體蛋白的表達(dá)進行關(guān)聯(lián)度分析的結(jié)果。從heatmap的結(jié)果能夠反映核糖體蛋白表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)度要顯著高于其他蛋白表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)度(利用圖c和圖a中的三張圖進行比較可以得出結(jié)論)。圖d是根據(jù)GO，分別對每一種特定功能對應(yīng)的蛋白質(zhì)group中的蛋白質(zhì)進行表達(dá)量的關(guān)聯(lián)度分析。

作者對不同分化階段的胚胎干細(xì)胞的蛋白質(zhì)進行關(guān)聯(lián)度分析之后，進行了主成分分析。作者的分析過程也就是將SCoPE-MS與一系列常規(guī)的組學(xué)的統(tǒng)計方法結(jié)合。作者首先對比了在bulk樣本中識別的不同蛋白質(zhì)豐度的數(shù)量分布和單細(xì)胞樣本中對應(yīng)的蛋白質(zhì)的分布情況(圖a)。由此可見，在單細(xì)胞中蛋白質(zhì)豐度總體要高于bulk樣本。

圖b是作者利用主成分分析day3、day5、day8的共計190個細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)差異。主成分分析的主要目的在于對蛋白質(zhì)的表達(dá)進行降維，選取三個主要成分能夠?qū)?90個細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況進行區(qū)分和可視化。圖c是作者所選取的3個主成分所對應(yīng)的方差解釋度和其他的相關(guān)信息。圖d-e展現(xiàn)的是作者對day8的細(xì)胞分別選取不同的兩個維度對兩類功能的相關(guān)蛋白質(zhì)group的表達(dá)水平進行可視化。

單細(xì)胞蛋白質(zhì)組和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的對比分析

最后，作者沿用了多組學(xué)的一貫套路，將單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)進行對比分析。

圖a是作者利用Klein在2015提供的胚胎干細(xì)胞不同分化階段的scRNAseq數(shù)據(jù)，對mRNA的表達(dá)進行關(guān)聯(lián)度分析。圖b是作者提供的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果。作者通過結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)，可以觀察基因是否能夠在mRNA和蛋白質(zhì)水平共同表達(dá)。圖c是作者利用圖a和圖b中的層次聚類結(jié)果，比較單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的overlap情況。圖d是蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)度和它們相對應(yīng)的mRNA的關(guān)聯(lián)度之間進行關(guān)聯(lián)度分析的結(jié)果。圖e反映了不同功能對應(yīng)的基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)協(xié)同性的情況，說明核糖體相關(guān)的蛋白質(zhì)(RPS和RPL)表達(dá)具有的協(xié)同性更高。

總結(jié)

選擇這篇文章的原因是近期我對單細(xì)胞多組學(xué)的有關(guān)研究的關(guān)注。過去有幾年的時間內(nèi)，我們關(guān)注的重心都是只停留在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組層面，但是蛋白質(zhì)是作為生物體行使主要功能的基本單位，對我們認(rèn)識生命的基本活動和病理變化均有重要意義。但是單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)距離發(fā)展成熟還有相當(dāng)遙遠(yuǎn)的一段距離。前段時間我看到《Nature Methods》上的一篇文章《Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics》，于是我產(chǎn)生了回溯近兩三年單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的興趣，我也會在后面更新一系列和單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)有關(guān)的文章。

這篇文章和很多單細(xì)胞領(lǐng)域的文章一樣，從介紹技術(shù)，并結(jié)合技術(shù)的應(yīng)用進行分析。但是由于這篇文章是單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的一個開端，因此存在著一系列缺陷，包括在文章的后半段也僅僅停留在一些比較簡單的統(tǒng)計方法和常規(guī)的思路上。盡管如此，這篇文章在開篇提出的技術(shù)方法，即結(jié)合液相色譜法和串聯(lián)質(zhì)譜法對單細(xì)胞層面的蛋白質(zhì)進行定量的方法具有開創(chuàng)性的意義。這項技術(shù)方法在第二代產(chǎn)品(SCoPE2)中有了很大的改進，無論是樣本的制備，還是質(zhì)譜分析方法都有了很大的改進。