前面我們已經(jīng)介紹過circRNA的基礎概念: 首先了解一下circRNA背景知識，背景知識，以及 circRNA芯片分析的一般流程，但是跟mRNA一樣，不僅僅是芯片可以檢測，也是可以使用NGS技術(shù)，就是circRNA-seq咯。

這里我們一起讀文獻：Circular RNAs expression profiles in plasma exosomes from early‐stage lung adenocarcinoma and the potential biomarkers 來看看cirRNA-seq分析的一般流程。

circRNA數(shù)據(jù)分析流程

重中之重其實就是circRNA的定量，在普通的mRNA-seq或者大家熟知的lncRNA-seq里面，我們都是正常的比對，每個reads都會有基因組坐標，然后跟我們的參考gtf文件進行坐標映射后計數(shù)即可。

但是cirRNA不太一樣，需要先鑒定出來，然后才能定量，比如本研究采用的是就DCC軟件流程，其實2015年12月10日發(fā)表在《Nucleic Acid Research》 的 https://www.ncbi.nlm./pubmed/26657634  ，文獻提到的5種算法預測得到的結(jié)果差別較大，而且有很高的假陽性，所以作者建議可以使用多種方法聯(lián)合預測或者采用去線性RNA建庫的方法進行circRNA研究。

首先看circRNA的注釋分類

前面我們提到過，circRNA的注釋很豐富了，CircRNA檢測的基本原理是去識別反向剪切的位點(backsplice)，最主要的circRNA類型是外顯子來源的，當然，在內(nèi)含子、間區(qū)、UTR區(qū)域、lncRNA區(qū)域以及已知轉(zhuǎn)錄本的反義鏈區(qū)域也都鑒定到circRNA，同一個位點可能形成多個circRNA，每個circRNA可能包含一個或多個外顯子。

比如本研究鑒定到的兩萬多個circRNA注釋后分類如下；

其實本研究還統(tǒng)計了circRNA在不同染色體的數(shù)量，還有其它數(shù)據(jù)庫收錄與否等等

表達矩陣的標準的差異分析

其實circRNA-seq和circRNA-array最后都是得到表達矩陣，然后就是走標準分析流程，火山圖，熱圖，GO/KEGG數(shù)據(jù)庫注釋等等。這些流程的視頻教程都在B站和GitHub了，目錄如下：

• 第一講：GEO，表達芯片與R

• 第二講：從GEO下載數(shù)據(jù)得到表達量矩陣

• 第三講：對表達量矩陣用GSEA軟件做分析

• 第四講：根據(jù)分組信息做差異分析

• 第五講：對差異基因結(jié)果做GO/KEGG超幾何分布檢驗富集分析

• 第六講：指定基因分組boxplot指定基因list畫熱圖

僅僅是最后得到的差異分子，并不是以前的mRNA后面的基因名，而是miRNA，lncRNA，甚至circRNA的ID，看起來很陌生罷了。感興趣可以細讀表達芯片的公共數(shù)據(jù)庫挖掘系列推文 ；

• 解讀GEO數(shù)據(jù)存放規(guī)律及下載，一文就夠

• 解讀SRA數(shù)據(jù)庫規(guī)律一文就夠

• 從GEO數(shù)據(jù)庫下載得到表達矩陣 一文就夠

• GSEA分析一文就夠（單機版+R語言版）

• 根據(jù)分組信息做差異分析- 這個一文不夠的

• 差異分析得到的結(jié)果注釋一文就夠

本文得到的熱圖如下：

也可以列出最顯著的那些circRNA的詳細信息，如下：

其實這里有一點點問題，看起來線粒體上面的cirRNA有些多了！

核心仍然是對circRNA定量和找差異

比如文章：RNA-Seq profiling of circular RNAs in human laryngeal squamous cell carcinomas