核酸體外擴增的設想最早是由Khorana在1971年提出的?！敖汥NA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可合成tRNA基因?！?br>

然而當時還沒有成熟的基因序列分析方法，也沒有熱穩(wěn)定DNA聚合酶以及引物合成操作很困難。這種設想達不到實際的效果。并且在70年代初出現(xiàn)了分子克隆技術，一種克隆和擴增基因的途徑被提供了，因此人們遺忘了Khorana的設想。

1983年4月的一個星期五晚上，Kary Mullis開車去鄉(xiāng)下別墅的路上,猛然閃現(xiàn)出“多聚酶鏈式反應”的想法；

1983年12月，Mullis用同位素標記法看到了10個循環(huán)后的49 bp長度的diyi個PCR片段；

1985年，Mullis在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。Mullis要合成DNA引物來進行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱；

1985年10月25日申請了PCR的專利，1987年7月28日批準（專利號4,683,202 ），Mullis是diyi發(fā)明人；

1985年12月20日在Science雜志上發(fā)表了diyi篇PCR的學術論文，Mullis是共同作者；

1986年5月，Mullis在冷泉港實驗室做專題報告，全世界從此開始學習PCR的方法。

根據(jù)PCR原理，商業(yè)公司在PCR儀的基礎功能上不斷進行創(chuàng)新和改進。至今，PCR儀已經更新至第三代技術。為方便讀者朋友理解，本文將對三代PCR儀的原理、特點、主要廠商及產品、應用領域做一系統(tǒng)梳理。

第一代——標準PCR儀

▲ 標準PCR反應過程

第三代——dPCR(數(shù)字PCR) 

不同于qPCR 對每個循環(huán)進行實時熒光測定的方法，數(shù)字 PCR 技術是在擴增結束后對每個反應單元的熒光信號進行采集。

數(shù)字PCR是一種基于PCR反應(聚合酶鏈反應)的單分子絕對定量技術。如圖1，在數(shù)字PCR的過程中：

(a) PCR反應體系(含有熒光染料或探針)被分割為數(shù)以萬計的均一微液滴，

(b) 其中部分微液滴內會含有一個或多個模板，

(c) 將這些微液滴收集到試管內進行PCR反應，其中含有模板的微液滴會產生擴增產物，由此具有較強的熒光，成為陽性微液滴，

(d) 在PCR反應完成后，依次對每個微液滴內的熒光進行檢測，

(e) 根據(jù)微液滴信號的峰值高度，繪制出微液滴熒光分布的散點圖，

(f) 通過合理的熒光分類閾值將微液滴內的熒光強度數(shù)字化，判斷出其中具有較強熒光的陽性微液滴(圖1f中綠色的數(shù)據(jù)點，稱為“1”)和具有較弱熒光的陰性微液滴(圖1f中藍色的數(shù)據(jù)點，稱為“0”)，并通過“1”和“0”的個數(shù)來實現(xiàn)絕對定量。因此，與實時定量PCR不同，數(shù)字PCR不需要使用標準曲線，即可直接對核酸拷貝數(shù)的絕對值進行定量。

▲ 數(shù)字PCR原理示意圖

最后通過直接計數(shù)或泊松分布公式計算得到樣品的原始濃度或含量。

迄今為止，目前市面上常見的數(shù)字PCR儀器主要有兩種，根據(jù)微反應的形成原理不同，主要分為 “芯片數(shù)字PCR”與“微滴數(shù)字PCR”兩類。

1.芯片數(shù)字PCR

▲ 芯片數(shù)字PCR原理圖

2.液滴數(shù)字PCR

▲ 微液滴數(shù)字PCR原理圖

基因擴增的基本要素與DNA復制的基本要素是一致的。

①DNA模板：待拷貝的DNA稱為模板，它可以是雙鏈DNA也可是單鏈DNA，Z后擴增得到的產物是雙鏈狀態(tài)的。

②引物：是DNA復制的先鋒，就象結晶過程中的晶核，引導DNA的合成。在PCR擴增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。

③DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)：是DNA復制的動力，在dNTP等底物存在時在引物的引導下沿著模板DNA合成互補的DNA鏈。

④緩沖液：提供DNA合成反應所需的pH，離子強度等環(huán)境。

⑤4種單核苷酸：dNTP，提供DNA合成原料。

基因擴增儀是利用PCR技術對特定基因做體外的大量合成，用于以檢測DNA/RNA為目的的各種基因分析。

PCR反應一般設置20~40次循環(huán)，每一循環(huán)包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三步反應。每一循環(huán)的產物作為下一個循環(huán)的模板。PCR的擴增效率很高，如果循環(huán)次數(shù)是30次，那么新生DNA片段理論上達到230拷貝(約為109個分子)。PCR反應每個循環(huán)的三個基本反應步驟如下：

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA產物解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備;

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;

③引物的延伸：溫度升到72℃左右，DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

熒光定量PCR儀操作規(guī)程

1.開始運行儀器

將PCR儀底座開關打開，再將定量PCR儀檢測器開關打開。在實驗之前，首先對系統(tǒng)預熱半個小時，打開電腦，將iQ5軟件啟動。

5.關閉運行儀器

實驗結束后將iQ5軟件、熒光定量檢測器及擴增系統(tǒng)電源關閉，將電腦關閉，將反應管取出。

盡管PCR儀器不是計量儀器，然而其的作用原理和基本計量要素有很密切的關系，因此，PCR儀需要定期檢測和維護。

儀器的維護保養(yǎng)

1．樣品池的清洗

首先將蓋子打開，然后在樣品池加入95%乙醇或10%清洗液，浸泡5min，然后對被污染的孔進行清洗，使用微量移液器對液體進行吸取，使用棉簽將剩余液體吸干。打開PCR儀，設定保持溫度為50℃使PCR程序運行，揮發(fā)去除殘余液體，通常只需要5-10分鐘左右。

2.熱蓋的清洗

對于熒光定量PCR儀，若出現(xiàn)熒光污染，并且樣品池不是這一污染的來源，或者當熱蓋的松緊受到污染或殘跡物的影響時，墊蓋底面需要用壓縮空氣或純水清洗，使樣品池的孔干凈，無污物阻擋光路得到保證。

3.儀器外表面的清洗

對儀器的外表面進行清洗能夠使灰塵和油脂除去，然而不能達到消毒的效果，對PCR儀的外表面進行清洗Z好選擇沒有腐蝕性的清洗劑。

4．更換保險絲

首先關掉PCR儀，將插頭拔取，將電源插口旁邊的保險盒打開，將備用的保險絲換上，觀察是否恢復正常。

儀器的維護和保養(yǎng)的注意事項

1)PCR儀器需要視制冷方式而定通常進行半年至少一次定期檢測。

2)PCR反應的要求溫度與實際分布的反應溫度不相同，如果通過檢測，與設置溫度相比較，各孔平均溫度差超過1～2℃，那么可以對PCR實際反應溫度差運用溫度修正法來糾正。

3)升、降溫過程的時間控制是PCR反應過程的關鍵時間越短越好，如果PCR儀的降溫過程高于1分鐘，那么就應該對儀器的制冷系統(tǒng)進行檢查。當PCR儀是使用風冷制冷時，其反應底座的灰塵要較徹底地清理，若是其他的制冷系統(tǒng)，那么應該對相關的制冷部件進行檢查。

4)通常情況下，如果儀器的溫度能夠采用溫度修正法糾正，那么不要輕易地對儀器的電子控制部件打開或調整。

A. 賽默飛

產品： 

B. 伯樂

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▲ CFX96 Touch 實時定量 PCR 儀      

C.天隆科技

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Gentier 96E 實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)

Gentier 48E/48R 實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng) 等

▲ Gentier 96E 實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)

D. Eppendorf 

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▲ Eppendorf Mastercycler nexus GX2 PCR儀     

E. 耶拿

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▲ 熒光定量梯度PCR儀

F.博日

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▲ 博日LineGene 9600 Plus熒光定量PCR儀    

G. STILLA

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▲ Naica 6通道微滴數(shù)字PCR系統(tǒng)

H. 力康

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力康Trident 960基因擴增儀

力康 T960 PCR儀 等

▲ 力康Trident 960基因擴增儀

I.朗基

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T20型雙槽梯度PCR儀

Q2000A型熒光定量PCR系統(tǒng) 等

▲ Q2000A型熒光定量PCR系統(tǒng)

J. 大龍

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大龍?zhí)荻然驍U增儀 TC1000-G

大龍實時熒光定量PCR系統(tǒng)Accurate 96 等

▲ 大龍?zhí)荻然驍U增儀 TC1000-G

K. 羅氏診斷

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LightCycle96 熒光定量PCR儀 等

L. QIAGEN

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QIAcuity Eight一體化集成數(shù)字PCR 系統(tǒng) 等

▲ QIAcuity Eight一體化集成數(shù)字PCR 系統(tǒng)

M.雅睿

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N. 宏石醫(yī)療

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SLAN-96P實時熒光定量PCR儀 等

O. 安譽科技

產品： 

AGT9601PCR擴增儀 等