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編譯：小北，編輯：夏甘草、江舜堯。 原創(chuàng)微文，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載。 導讀
糖酵解和線粒體呼吸之間的生物能量平衡對干細胞命運的特異性特別重要。然而未分化的精原細胞在分化過程中是否轉(zhuǎn)向生物能量產(chǎn)生尚未確定。在本研究中研究者發(fā)現(xiàn)精原細胞中ATP的產(chǎn)生在視黃酸(RA)誘導分化后逐漸升高。為了適應能源需求的增加，RA信號同時將精原體內(nèi)ATP的產(chǎn)生從糖酵解轉(zhuǎn)變?yōu)榫€粒體呼吸，伴隨著活性氧含量的增加。破壞線粒體呼吸顯著阻斷了精原細胞分化。抑制葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸或磷酸戊糖信號通路也抑制了c-Kit+分化生殖細胞的形成。糖酵解的代謝產(chǎn)物是精原細胞分化所必需的。研究者進一步通過RNA-seq和蛋白組學定量分析證實一些代謝調(diào)節(jié)因子和酶的表達水平在RA誘導分化后顯著改變。總之研究者的結(jié)果證實在糖酵解和線粒體呼吸之間嚴格調(diào)控的生物能量平衡是精原細胞增殖和分化所必需的。原名：A bioenergetic shift is required for spermatogonial differentiation 譯名：精原細胞分化需要生物能量轉(zhuǎn)換 期刊：Cell discovery 影響因子：6.255 作者：Yuan Wang 單位：華東師范大學 發(fā)表時間：2020年8月18日 DOI：10.1038/s41421-020-0183-x 精原干細胞(SSCs) 在精子發(fā)生以及出生后生殖細胞發(fā)育過程中維持著一些未分化的精原祖細胞。在這一過程中，未分化的精原細胞瞬時增殖并且對發(fā)育中的因素例如RA作出應答，成為分化的精原細胞，并進一步發(fā)育為精母細胞并且通過減數(shù)分裂形成單倍體精子。因此理解精原細胞增殖和分化是如何平衡的對于維持適當?shù)木影l(fā)生是非常重要的。在成年小鼠中SSCs是稀少的并且只占生殖細胞群的~0.03%。相反體外培養(yǎng)的精原細胞能夠長期增殖，并且為基因和環(huán)境對出生后生殖細胞發(fā)育的研究提供了可行的平臺。CD90和CD9表面抗原通常富集在未分化精原細胞以及高表達標記物基因，如ID4,GFRα1, PLZF等的SSCs上。C-Kit的表達標志著分化的精原細胞以及早期精母細胞的出現(xiàn)。FGF2和GDNF是維持精原細胞增殖所必需的，而RA處理后，CD90+/CD9+/c-Kit?精原細胞開始分化為c-Kit+細胞，該細胞中STRA8和SYCP3是上調(diào)的。具有SSC能力的未分化精原細胞能夠進一步通過睪丸外植體到Kitw/w-v小鼠中評估其減數(shù)分裂以及再生完整的精子發(fā)生的潛能，該模型是通常應用的內(nèi)源生殖細胞發(fā)育缺陷的受體小鼠模型。 所有哺乳動物細胞都能通過糖酵解和線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生不同比例的ATP。這些細胞內(nèi)過程不僅產(chǎn)生能量，還能為細胞分裂、種系發(fā)育以及表觀修飾提供重要的代謝中間物。糖酵解和氧化磷酸化OXPHOS之間緊密調(diào)節(jié)的平衡對于干細胞的自我更新和分化特別重要。有報道稱糖酵解的活化以及OXPHOS的抑制能夠提高體細胞向誘導型多能干細胞重編程的效率。特別是對于生殖細胞，越來越多的證據(jù)表明一個復雜的轉(zhuǎn)錄因子、代謝驅(qū)動因子以及信號通路中的分子網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用以維持糖酵解和OXPHOS之間生物能量的平衡。例如單細胞RNA-seq發(fā)現(xiàn)在精子發(fā)生不同階段代謝驅(qū)動因子差異表達。此外，F(xiàn)OXO1能夠調(diào)節(jié)MYC/MYCN 轉(zhuǎn)錄因子的表達，反之調(diào)節(jié)影響SSC自我更新的細胞周期和糖酵解。大多數(shù)研究提示成人干細胞坐落在一個低氧張力的生態(tài)位，因此依賴糖酵解產(chǎn)生能量以避免OXPHOS產(chǎn)生的ROS造成的DNA損傷。然而，SSCs和未分化的精原細胞坐落在精小管的基部，有一層精母細胞和精子細胞依次從基部向管腔遷移的區(qū)域。由于血管在輸精管之間，氧氣只能通過擴散的方式到達腔內(nèi)。與減數(shù)分裂以及減數(shù)分裂后的生殖細胞相比，精原細胞相對更易獲得氧氣。的確，有報道稱ROS是小鼠SSC通過活化P38/MAPK和JNK信號通路實現(xiàn)自我更新所必需的。然而，近期的研究也表明缺氧培養(yǎng)條件下糖酵解的增加有利于SSC的建立以及長期維持。在精原細胞分化過程中糖酵解和OXPHOS之間平衡是否改變以及這一過程是否需要一個高水平的OXPHOS 尚未明確。研究者因此進行試驗證實在精原細胞分化中代謝的改變及其調(diào)節(jié)機制。利用體外分化的平臺，研究者發(fā)現(xiàn)未分化的精原細胞適應了一個與分化群體不同的能量傾向。此外，研究者確定了一些新的代謝調(diào)節(jié)因子在未分化的和分化的精原細胞中差異表達。生物能量平衡的破壞將會導致精原細胞生殖和分化受到破壞，由此說明代謝調(diào)節(jié)在精原細胞命運的特異性中發(fā)揮重要作用。為了理解出生后生殖細胞發(fā)育過程中代謝的改變，研究者首先建立了一個體外精原細胞培養(yǎng)和分化的平臺。未分化的精原細胞呈典型的簇狀葡萄樣克?。▓D1a），并且通過流式分析發(fā)現(xiàn)90%的表達細胞表面抗原CD90和CD9（圖1b）。在RA誘導的分化中精原細胞克隆集落連接松散（圖1a）并且開始分化為c-Kit+細胞（圖1b）。此外，未分化的精原細胞高表達SSC標記物，例如應答RA處理后下調(diào)的ID4, GFRα1, and PLZF（圖1c、d）。相反，在RA誘導c-Kit+分化的細胞中c- Kit, STRA8,以及SYCP3的RNA水平和蛋白水平都升高（圖1b-d）。在體外維持精原細胞以及體內(nèi)發(fā)展的CD9+/c-Kit?細胞之間標記基因(Gfrα1, Plzf, Id4, Ngn3)的表達沒有統(tǒng)計學顯著差異（圖1e）。同樣c-Kit和Sycp3在體外RA處理的群體以及c-Kit+細胞中的表達水平相當（圖1e）。然而，研究者發(fā)現(xiàn)與體內(nèi)相比，體外培養(yǎng)的細胞Gfrα1 和Stra8的表達水平升高（圖1e）。一個可能的解釋是體內(nèi)分離的群體與高度的異質(zhì)性相關(guān)。例如，分離的c-Kit+細胞包括不同發(fā)育階段的分化細胞，能夠表達不同水平的Stra8。CD9+/c-Kit?細胞包含不同發(fā)育階段未分化的精原細胞并且可能受一些表達CD9的基質(zhì)細胞污染。體外培養(yǎng)有利于未分化精原細胞的生長并且使它們對RA處理的應答以一個更加同質(zhì)的方式同步。Stra8表達升高的另一種可能是由于體外高的RA誘導劑量。然而，在Kitw/w-v小鼠的睪丸中能維持超過4個月的未分化的精原細胞在輸精管移植后重建精子發(fā)生并且形成ACR+以及PNA+的精子細胞（圖1f-h），該模型內(nèi)源生殖細胞發(fā)育缺陷。相反，在RA處理組中第四周觀察分化的精原細胞，在移植后2個月并未檢測到精子細胞（圖1f-h），提示RA能夠充分誘導分化。總之，研究者成功的建立了一個精原細胞培養(yǎng)的體外分化平臺。
圖1建立精原細胞培養(yǎng)和體外分化的平臺 Establishin 為了確定在精原細胞分化過程中代謝的動態(tài)變化，研究者首先在RA誘導下評估了ATP的水平以及ROS的產(chǎn)生。研究者發(fā)現(xiàn)ATP的水平在開始是降低的，但是在RA處理第三天顯著升高（圖2a），提示精原細胞分化過程中能量產(chǎn)生和消耗之間平衡的動態(tài)改變。有趣的是，ROS的水平在24h開始升高并且在RA誘導后48h顯著升高（圖2b），提示在精原細胞分化過程中線粒體OXPHOS的升高。為了進一步確定精原細胞分化過程中不斷變化的代謝偏好性，研究者建立了一個包含熒光胞漿SoNar傳感器的原生精原細胞系，傳感器的輕度反應了胞漿中NAD+和NADH氧化還原的狀態(tài)。一般而言，糖酵解產(chǎn)生NADH，傳遞至線粒體后氧化為NAD+或者當在胞漿中由丙酮酸產(chǎn)生乳酸時通過乳酸脫氫酶(LDH)再循環(huán)成NAD+。因此胞漿內(nèi)NAD+/NADH比值是由這三條信號通路網(wǎng)絡(luò)平衡決定的。研究者發(fā)現(xiàn)未分化的精原細胞相對于RA誘導24小時分化的精原細胞具有更高的NAD+/NADH比率（圖2c）。當草氨酸處理封閉LDH的活性時，未分化精原細胞中NAD+/NADH的比率顯著降低（圖2c），提示細胞中從丙酮酸向乳酸轉(zhuǎn)化的活化。相反，分化的精原細胞并不能很好的應答草酸鹽抑制（圖2c），因為不同發(fā)育階段的生殖細胞可能表達不同的LDH異構(gòu)體，研究者檢測了應答草酸鹽抑制時LDH的活性并且證實在兩個群組中草酸鹽處理能夠有效的抑制LDH的活性。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，當直接測量時，在未分化精原細胞中LDH的活性顯著高于RA處理分化的群體（圖2d）。研究者通過在野生小鼠體內(nèi)發(fā)育的CD9+/c-Kit?未分化精原細胞以及c-Kit+分化精原細胞中評估LDH的活性，進一步證實了這些結(jié)果（圖2e）。此外，研究者近期報道在c-Kit+分化的精原細胞中ROS的水平顯著高于那些體內(nèi)發(fā)育的CD90+/c-Kit?未分化的精原細胞。因此這些證據(jù)證實在生理條件下精原細胞分化過程中糖酵解降低，OXPHOS升高。盡管間質(zhì)體細胞例如睪丸中的Leydig細胞也表達c-Kit，這些細胞大部分是在多個精原細胞分離過程中利用連續(xù)胰酶和膠原酶從細精管上剝離的。利用實時定量RT-PCR分析分選高表達生殖細胞標記物的c-Kit+細胞。最終，為了排除這些代謝的改變是由于RA處理的直接效應，研究者在同一RA處理的群體中收集了c-Kit?和c- Kit+細胞并且檢測了它們LDH的活性。在c-Kit?精原細胞中LDH的活性顯著更高，由此證實代謝的轉(zhuǎn)變并不是RA處理的轉(zhuǎn)變，而是由精原細胞發(fā)育階段決定的。總之，這些結(jié)果提示精原細胞分化后氧化還原狀態(tài)發(fā)生改變，并且需氧糖酵解在未分化精原細胞中高度活化使丙酮酸向乳酸轉(zhuǎn)化再生NAD+。利用Seahorse細胞外通量分析儀，研究者接下來在未分化精原細胞以及RA誘導24h和48h后分化精原細胞中檢測了細胞外酸化速率(ECAR)。原則上，ECAR反應了Krebs循環(huán)中糖酵解和質(zhì)子貢獻。研究者發(fā)現(xiàn)在RA誘導分化的24h，分化的精原細胞中糖酵解的能力降低，并且在48小時后進一步降低，實驗結(jié)果由連續(xù)加糖、寡霉素（抑制OXPHOS）、2-DG（抑制糖酵解）后ECAR最大變化值計算，提示在未分化精原細胞中糖酵解的活性更高（圖2f）。為了進一步區(qū)分Krebs循環(huán)糖酵解的酸化作用，研究者在葡萄糖，L-谷氨酰胺，丙酮酸存在時順次添加魚藤酮/抗霉素A(阻斷OXPHOS)以及2-DG檢測了未分化精原細胞和RA誘導后細胞的質(zhì)子外流率(PER)（圖2g）。除線粒體衍生的酸化和代償性糖酵解外這兩種基礎(chǔ)的糖酵解沿著分化軌跡逐步降低，由此說明在未分化精原細胞中糖酵解的水平更高。此外，研究者分析了代表線粒體呼吸水平的耗氧率(OCR)，并且發(fā)現(xiàn)在RA處理48h后分化的精原細胞基礎(chǔ)OCR的水平升高（圖2h）。線粒體呼吸的最大量通過連續(xù)添加寡霉素后OCR以及添加抗霉素A后FCCP的變化測量，并且發(fā)現(xiàn)在RA處理24h和48h后顯著升高（圖2h），提示精原細胞分化中線粒體呼吸上調(diào)。總之研究者的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)精原細胞分化過程中從糖酵解到線粒體呼吸代謝的轉(zhuǎn)變。
圖2 在未分化和分化的精原細胞中不同的能量偏好性 在糖酵解途徑抑制葡萄糖-6-磷酸和戊糖的產(chǎn)生抑制精原細胞的分化 為了確定精原細胞分化過程中重要的代謝通路，研究者在糖酵解的不同步驟利用抑制劑處理了細胞（圖3a）。與上述分化精原細胞更傾向于OXPHOS產(chǎn)生能量一致，enoblock能抑制從2-磷酸甘油酸到磷酸烯醇丙酮酸的形成，但對精原細胞分化沒有影響，在RA誘導的c-Kit+細胞中與對照組中的比例相似（圖3a、b）。同樣，抑制丙酮酸向乳酸轉(zhuǎn)化的草酸酯在60 mM或者更低的濃度下對精原細胞分化沒有明顯的影響。在120mM的高濃度下，草酸脂引起明顯的細胞死亡，這可能是細胞毒性的結(jié)果。有趣的是，2-DG是一種糖原類似物，能夠抑制糖酵解的起始步驟從葡萄糖到葡萄糖-6-磷酸(G6P)，在處理24小時內(nèi)顯著封閉精原細胞分化（圖3a、d）。在2-DG處理細胞中RA誘導后c-Kit+細胞的比例降低至23.8%，而對照組為93.6%（圖3a、d）。能夠催化葡萄糖到G6P的己糖激酶的另一種抑制劑氯尼達明處理后，能夠?qū)е孪嗨频慕Y(jié)果（圖3a、e），證實G6P的形成在精原細胞分化中非常重要。由于G6P能夠通過磷酸戊糖途徑（PPP）合成核苷酸，研究者猜想精原細胞分化降低可能是由于代謝供應減少，例如用于核苷酸合成的5-磷酸核糖。研究者利用在PPP第一步能夠催化G6P生成6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯的G6P脫氫酶的抑制劑6-氨基煙酰胺對該假說進行了檢測（圖3a）。的確，6-氨基煙酰胺能夠顯著封閉精原細胞的分化，導致c-Kit+細胞從93.6%降低到27.9%（圖3f）?？傊芯空叩臄?shù)據(jù)提示在糖酵解和PPP中活化G6P的形成是精原細胞分化所必需的。利用相同濃度的抑制劑，研究者進一步檢測了精原細胞維持中的影響。CD90+/c-Kit?未分化精原細胞的比例并未發(fā)現(xiàn)明顯的改變（圖3b、d、f）。在氯尼達明處理24h后克隆形成的大小輕微降低。隨著SSC群體每隔5-6天數(shù)量翻倍，短期糖酵解的抑制并不能檢測到精原細胞維持的缺陷。然而，氯尼達明處理后能夠顯著降低SSC標記物Gfrα1和Id4的表達水平。在早期分化的精原細胞中主要表達的基因Ngn3在2-DG、6-氨基煙酰胺或者enoblock處理后升高（圖3g）。研究者進一步發(fā)現(xiàn)延長2-DG處理2-3天將會導致精原細胞克隆大小和細胞數(shù)量的顯著降低（圖3h），提示糖酵解的抑制也能損害精原細胞的自我更新。
圖3在糖酵解中從葡萄糖到G6P的形成是精原細胞分化所必需的 抑制OXPHOS能夠封閉精原細胞分化 利用相同的策略研究者通過不用抑制劑靶向線粒體呼吸鏈確定在精原細胞分化過程中需要OXPHOS中特異的酶復合體。這些抑制劑包括魚藤酮對抗復合物I、抗霉素A抑制絡(luò)合物III、抑制ATP合成功能的寡霉素以及通過破壞線粒體膜破壞ATP合成的FCCP（圖4a）。所有這些抑制劑能夠在RA誘導24h內(nèi)顯著阻止c-Kit+細胞的形成（圖4b-d），說明在精原細胞分化中非常需要OXPHOS。相同的抑制劑處理并不改變CD90+/c-Kit?未分化精原細胞的比例（圖4b-d）并且精原細胞的形態(tài)在24小時處理后是正常的。研究者進一步通過實時熒光定量RT-PCR檢測了SSC標記基因的表達。研究者發(fā)現(xiàn)魚藤酮處理并沒有效果，但是抗霉素A、FCCP以及寡霉素都能使Gfrα1的表達水平降低（圖4e）。此外，魚藤酮或者寡霉素延長處理2-3天能夠顯著降低精原細胞數(shù)量和克隆的大小（圖4f），提示線粒體呼吸是精原細胞長時間維持增殖所需要的。
圖4 精原細胞分化需要OXPHOS 精原細胞分化過程中代謝調(diào)節(jié)因子差異表達 為了系統(tǒng)的探究在精原細胞分化過程中代謝改變的分子機制，研究者對未分化精原細胞以及36小時RA誘導后的細胞進行了RNA-seq分析以評估其全基因組表達圖譜。研究者證實SSC的標記基因，例如Gfrα1, Id4, Plzf, Etv5, 以及Sall4在未分化精原細胞中高表達（圖5a）。相反，提示精原細胞分化的基因，例如Sycp3, Stra8, 以及c-Kit在RA誘導后顯著升高（圖5a）。有趣的是，這兩個細胞群在一些代謝酶的水平上也表現(xiàn)出變化的差異，包括糖酵解中的如HKs,Aldoa, Eno1/2, 以及Ldha/b（圖5a）。更重要的是，一些已知的代謝調(diào)節(jié)因子如Pdk1/2, Srf, c-Myc, 以及Mycn在RA誘導群體的未分化的精原細胞中表達水平不同（圖5a）。與這些結(jié)果一致的是，利用KEGG數(shù)據(jù)庫進行GO分析發(fā)現(xiàn)在未分化的和分化的精原細胞中糖酵解在差異調(diào)節(jié)信號通路中居首。研究者進一步通過獨立實驗中所有RNAs的實時熒光定量RT-PCR驗證了這些RNA-seq的結(jié)果。在糖酵解中一些酶的水平在精原細胞分化的不同階段的確下調(diào)（圖5b）。例如， 催化丙酮酸到乳酸轉(zhuǎn)變的酶Ldha和Ldhb的表達水平在RA處理24小時后降低（圖5b），與研究者觀察到的產(chǎn)生能量的需氧糖酵解在未分化的精原細胞中高度活化，盡管在RA處理48h的分化精原細胞中Ldha和Ldhb的轉(zhuǎn)錄水平與未分化的精原細胞具可比性（圖5b），LDH的活性測量實驗以及Seahorse對ECAR的分析提示它們的蛋白水平和活性似乎仍然維持在很低的水平（圖2），提示LDH酶活性的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。顯著的是，研究者發(fā)現(xiàn)己糖激酶異構(gòu)體的差異表達。異構(gòu)體Hk2在整個分化過程中下調(diào)（圖5c）；另一方面Hk3的表達在24h RA誘導后沒有改變但是在48h RA誘導后顯著上調(diào)（圖5c），提示在精原細胞分化過程中階段特異異構(gòu)酶的差異調(diào)節(jié)機制。有趣的是，F(xiàn)OX家族中的一些成員在RA誘導分化中的一些未分化精原細胞中差異表達（圖5a、d）。為了驗證在體內(nèi)精原細胞分化過程中這些酶和調(diào)節(jié)因子是否具有相似的表達圖譜，研究者對小鼠睪丸中分選得到的CD9+/c-Kit?未分化的以及c-Kit+分化的精原細胞進行了實時熒光RT-PCR，的確，研究者發(fā)現(xiàn)在CD9+/c- Kit?未分化的精原細胞中糖酵解的酶高表達，而在c-Kit+細胞中線粒體調(diào)節(jié)因子高表達（圖5e）。此外，一些代謝調(diào)節(jié)因子（如Fox基因和Mycn）在體內(nèi)精原細胞發(fā)育過程中與體外發(fā)現(xiàn)的具有相似的表達圖譜（圖5e）。因為代謝調(diào)節(jié)因子和酶也可能受蛋白質(zhì)翻譯、翻譯后修飾或者酶異構(gòu)體差異表達的調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄的水平可能反應未分化和分化精原細胞間這些基因的一些而不是所有改變。為了理解精原細胞分化過程中基因表達在蛋白水平的變化，研究者進一步對未分化精原細胞和RA誘導分化群體的蛋白組學進行定量。共計定量了4879個蛋白并且在這兩個群體中502個蛋白差異表達。與RNA-seq分析結(jié)果一致的是，在糖酵解中一些重要的酶，例如HK2,ALDOA, PGK1, PKM, 以及LDHA在分化的精原細胞中顯著降低（圖5f）。通過磷酸化丙酮酸脫氫酶抑制檸檬酸循環(huán)的激酶PDK1也是下調(diào)的（圖5f）。重要的是，GO富集分析說明在未分化的和分化的精原細胞中所有差異調(diào)節(jié)的細胞過程中參與代謝過程的蛋白位居首位（圖5g）?？傊芯空叩慕Y(jié)果提示在未分化的和分化的精原細胞中代謝調(diào)節(jié)因子在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的差異表達圖譜，并且這些似乎在精原細胞分化過程中驅(qū)動從糖酵解到線粒體呼吸的代謝轉(zhuǎn)換。
圖5 精原細胞分化過程中代謝調(diào)節(jié)因子的差異表達 在本研究中研究者發(fā)現(xiàn)精原細胞中ATP的產(chǎn)生在視黃酸(RA)誘導分化后逐漸升高。為了適應能源需求的增加，RA信號同時將精原體內(nèi)ATP的產(chǎn)生從糖酵解轉(zhuǎn)變?yōu)榫€粒體呼吸，伴隨著活性氧含量的增加。破壞線粒體呼吸顯著阻斷了精原細胞分化。抑制葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸或磷酸戊糖信號通路也抑制了c-Kit+分化生殖細胞的形成。糖酵解的代謝產(chǎn)物是精原細胞分化所必需的。研究者進一步通過RNA-seq和蛋白組學定量分析證實一些代謝調(diào)節(jié)因子和酶的表達水平在RA誘導分化后顯著改變。總之研究者的結(jié)果證實在糖酵解和線粒體呼吸之間嚴格調(diào)控的生物能量平衡是精原細胞增殖和分化所必需的。
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