【原】科研 | Nat. Commun.：非酒精性脂肪肝相關(guān)性肝癌患者的腸道菌群或抑制外周免疫

微科享 2021-04-19

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編譯：微科盟北越城主，編輯：微科盟Tracy、江舜堯。

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導(dǎo)讀

前期研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌（HCC）的免疫反應(yīng)。在本研究中，我們采用宏基因組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)來表征非酒精性脂肪肝（NAFLD）相關(guān)性肝硬化患者（無(wú)論是否患有HCC）的腸道菌群，并在離體模型中評(píng)估其對(duì)外周免疫應(yīng)答的影響。我們發(fā)現(xiàn)隨著肝癌的病理發(fā)展腸道菌群發(fā)生組成和功能改變，NAFLD-肝硬化患者的微生物群紊亂是其主要特征，而對(duì)NAFLD-HCC中微生物群的基因功能分析發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸的合成變化，并通過代謝組學(xué)研究得到證實(shí)。離體研究表明，NAFLD-HCC微生物群（而非對(duì)照組）的細(xì)菌提取物會(huì)引起T細(xì)胞免疫抑制，其特征在于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的擴(kuò)增和CD8⁺T細(xì)胞的衰減。我們的研究表明，NAFLD-HCC中的腸道菌群具有獨(dú)特的微生物組/代謝組學(xué)特征，并且可以調(diào)節(jié)外周免疫應(yīng)答。

論文ID

原名：Gut microbiota impact on the peripheral immune response in non-alcoholic fatty liver disease related hepatocellular carcinoma

譯名：非酒精性脂肪肝相關(guān)性肝癌患者的腸道菌群或抑制外周免疫

期刊：Nature Communications

IF：12.121

發(fā)表時(shí)間：2021.01

通訊作者：Amany Zekry

通訊作者單位：新南威爾士大學(xué)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 隊(duì)列研究的基礎(chǔ)生理指標(biāo)特征

這項(xiàng)研究共招募了90名受試者；NAFLD-HCC患者32例，NAFLD肝硬化患者28例，非NAFLD對(duì)照患者30例。所有組的年齡，性別和BMI均匹配（表1）。

所有受試者NAFLD-HCC和NAFLD-肝硬化的瞬時(shí)彈性成像評(píng)分與肝硬化結(jié)果一致(表1)。我們根據(jù)肝功能分級(jí)和模型對(duì)NAFLD-HCC和NAFLD-肝硬化患者的肝病嚴(yán)重程度進(jìn)行匹配終末期肝病鈉(MELD-Na)評(píng)分(表1)。NAFLD-HCC組和NAFLD-肝硬化組的肝臟生化指標(biāo)無(wú)差異，在臨床、影像學(xué)或內(nèi)窺鏡檢查中均無(wú)門靜脈高壓的證據(jù)。

在NAFLD-HCC和NAFLD肝硬化組中，II型糖尿病，原發(fā)性高血壓，血脂異常或二甲雙胍的使用均無(wú)差異（表1）。然而，與非NAFLD對(duì)照相比，患有肝?。?/span>NAFLD-HCC或NAFLD-肝硬化）的受試者的代謝疾?。?/span>II型糖尿病，原發(fā)性高血壓和血脂異常），二甲雙胍的使用和肝臟患病率更高（表1）。

所有患有NAFLD-HCC的受試者均接受了手術(shù)切除（具有治愈意圖）以治療HCC，并在組織學(xué)上證實(shí)了肝硬化和HCC。表2顯示了其他相關(guān)的腫瘤特征，包括腫瘤數(shù)量，大小，巴塞羅那臨床肝癌（BCLC）分期，腫瘤等級(jí)，術(shù)前HVPG和甲胎蛋白水平。

表1 研究隊(duì)列的基線特征

數(shù)值用平均值(±SD)或%表示。P值的計(jì)算采用單因素方差分析，對(duì)連續(xù)變量采用T檢驗(yàn)，對(duì)二元變量采用卡方檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在NAFLD -肝硬化組和NAFLD-HCC組中，所有變量均無(wú)顯著差異。BMI體重指數(shù)，終末期肝病的MELD-Na模型-鈉，谷丙轉(zhuǎn)氨酶，天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值，ns無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 NAFLD-HCC組的腫瘤特征

BCLC階段巴塞羅那臨床肝癌階段，HVPG肝靜脈壓力梯度。

2.外周血中的基線免疫細(xì)胞定量

與NAFLD肝硬化和非NAFLD對(duì)照相比，NAFLD-HCC受試者在基礎(chǔ)生理指標(biāo)上具有更高比例的調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Tregs;CD3⁺ CD4⁺CD25⁺ Foxp3⁺）（圖1）。相反，NAFLD-HCC受試者的CD8⁺ T細(xì)胞（CD3⁺ CD8⁺ ）百分比低于NAFLD肝硬化和非NAFLD對(duì)照（P= 0.017）（圖1）。NAFLD肝硬化和非NAFLD對(duì)照之間的Tregs或CD8⁺ T細(xì)胞百分比沒有差異（圖1）。

圖1 與NAFLD-肝硬化和非NAFLD對(duì)照相比，NAFLD-HCC的受試者在基線時(shí)有外周免疫抑制

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs;CD3⁺ CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ )和CD8⁺ T細(xì)胞(CD3⁺ CD8⁺ )在非NAFLD對(duì)照、NAFLD肝硬化和NAFLD-HCC受試者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)的定量結(jié)果。非nafld對(duì)照30例，nafld肝硬化28例，nafldhcc 32例，作為生物獨(dú)立樣本。數(shù)據(jù)以CD3⁺ 淋巴細(xì)胞百分比表示。3組比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)計(jì)算P值。

3.宏基因組測(cè)序證實(shí)了肝病中的營(yíng)養(yǎng)不良，并在NAFLD-HCC中鑒定出一個(gè)產(chǎn)生SCFA的腸道微生物菌屬

與非NAFLD對(duì)照相比，糞便樣品的宏基因組測(cè)序證實(shí)了NAFLD-HCC和NAFLD-肝硬化的營(yíng)養(yǎng)不良（圖2a，b）。與非NAFLD對(duì)照相比NAFLD-HCC和NAFLD肝硬化患者的降低了α-多樣性指數(shù)和觀察到的物種數(shù)量（圖2a）。與非NAFLD對(duì)照組相比，NAFLD-HCC和NAFLD肝硬化患者在控制年齡和性別時(shí)通過原則約束分析（CAP）確定的β-多樣性顯著不同（圖2b）。

在門的水平上，與非NAFLD對(duì)照相比NAFLD-HCC的顯著特征是變形菌門豐度顯著增加，而與NAFLD肝硬化相比則沒有變化（圖2c）。同時(shí)在門水平上，各組之間沒有其他差異，但是，在科的水平上，與NAFLD肝硬化和非NAFLD對(duì)照相比，在NAFLD-HCC中觀察到腸桿菌科豐度顯著增加。與非NAFLD對(duì)照相比，NAFLD-HCC的顯著特征還在于減少了Oscillospirace和Erysipelotrichaceae，但與NAFLD肝硬化相比卻沒有變化（圖2d）。另外，在NAFLD-肝硬化隊(duì)列中，我們?cè)诳频乃缴嫌^察到了微生物組組成的變化。與NAFLD-HCC（P= 0.013）和非NAFLD對(duì)照相比，NAFLD肝硬化的特征是真桿菌科的豐度顯著增加（圖2d）。此外，與非NAFLD對(duì)照相比，我們?cè)?/span>NAFLD肝硬化患者中觀察到了結(jié)腸桿菌科豐度的增加和幾種擬桿菌豐度的減少：包括毛霉菌科，惡臭桿菌科和原核科（圖2d）。

在物種水平上，我們對(duì)微生物組的分析發(fā)現(xiàn)與非NAFLD對(duì)照相比，發(fā)現(xiàn)在NAFLD-HCC和NAFLD-肝硬化中均顯著富集的常見細(xì)菌物種（圖2e），包括木桿菌，魯米諾球菌和博氏梭狀芽胞桿菌（圖2d）。重要的是，LEfSe分析發(fā)現(xiàn)了B.caecimuris和V.parvula能將NAFLD-HCC與NAFLD肝硬化區(qū)分開來。因此， NAFLD-HCC微生物組富含五個(gè)細(xì)菌物種（圖2e），而先前有報(bào)道它們是具有免疫調(diào)節(jié)能力的SCFA生產(chǎn)者。

圖2 患有NAFLD-HCC，NAFLD-肝硬化和非NAFLD對(duì)照的受試者的糞便微生物分析

a.基于非NAFLD對(duì)照，NAFLD-肝硬化和NAFLD-HCC糞便樣本中觀察到的物種數(shù)量的Alpha多樣性。b.使用原則約束分析（CAP）（按年齡和性別控制）的Beta-多樣性。c.在非NAFLD對(duì)照，NAFLD肝硬化和NAFLD-HCC糞便樣本中門水平的微生物組組成變化。d.在非NAFLD對(duì)照，NAFLD肝硬化和NAFLD-HCC糞便樣本中科水平的的微生物組組成變化。e.與非NAFLD對(duì)照糞便樣本相比，患有NAFLD-HCC，NAFLD-肝硬化糞便樣本中豐度最高的5種菌株。

4. 從膳食纖維中合成短鏈脂肪酸的細(xì)菌基因是NAFLD-HCC患者微生物組的最重要特征

為了確認(rèn)富含NAFLD-HCC微生物的物種具有產(chǎn)生SCFA的能力，我們測(cè)量了來自NAFLD-HCC，NAFLD-肝硬化和非NAFLD對(duì)照的樣本糞便中負(fù)責(zé)SCFA合成的細(xì)菌基因的豐度（圖3a）。

在先前研究中顯示對(duì)SCFA合成很重要的21個(gè)候選基因中，五個(gè)基因的豐度在各組之間顯著不同，更重要的是，與NAFLD肝硬化和非NAFLD對(duì)照相比，NAFLD-HCC中負(fù)責(zé)由丙酮酸生產(chǎn)草酰乙酸的丙酮酸羧化酶（pycA）過度表達(dá)（P= 0.004）（圖3b）。此外，與NAFLD肝硬化和非NAFLD對(duì)照相比，NAFLD-HCC中與乙酸酯合成（磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶；pta）和丁酸酯/乙酰磷酸合成（磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶；ptb）相關(guān)的基因均過表達(dá)（圖3b）。但是，并非所有對(duì)乙酸鹽和丁酸鹽合成重要的基因都在NAFLD-HCC微生物組中過表達(dá)，例如，對(duì)于乙酸激酶（ackA）和丁酸激酶（butK），各組之間的基因表達(dá)沒有差異。

此外，與非NAFLD對(duì)照相比，NAFLD-HCC微生物組中丙酸合成途徑中的兩個(gè)基因，即富馬酸還原酶（frd）和琥珀酸-CoA合成酶（sucC）過表達(dá)。但是，在NAFLD-HCC和NAFLD肝硬化之間未見這些基因豐度的差異，在NAFLD肝硬化和非NAFLD對(duì)照之間未見差異（圖3b）。

圖3 從膳食纖維中合成短鏈脂肪酸的細(xì)菌基因是NAFLD-HCC患者微生物組的最重要特征

a.微生物介導(dǎo)的短鏈脂肪酸合成途徑。b.與NAFLD-肝硬化和非NAFLD-對(duì)照相比，NAFLD-HCC糞便SCFA合成基因的相對(duì)豐度變化。pycA丙酮酸羧化酶，pta

磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶，磷酸ptb磷酸丁?；D(zhuǎn)移酶，富馬酸frd還原酶，sucC琥珀酸-CoA合成酶，KO KEGG Orthology。

5. 代謝組學(xué)研究表明，NAFLD-HCC受試者的糞便和血清中SCFA及其中間體的濃度升高

我們對(duì)來自NAFLD-HCC、NAFLD肝硬化和非NAFLD對(duì)照的糞便和血清樣本對(duì)進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，以測(cè)量SCFA及其中間體。

在糞便中，我們用LC–MS/ MS測(cè)定了對(duì)細(xì)菌代謝過程重要的65種代謝物，發(fā)現(xiàn)NAFLD-HCC患者中有三個(gè)具有特征的代謝物變化，包括草酰乙酸，乙酰磷酸和異檸檬酸。草酰乙酸和乙酰磷酸是已知的SCFA中間體（圖3a），與NAFLD肝硬化和非NAFLD對(duì)照相比，NAFLD-HCC受試者的糞便中糞便的乙酸草酸酯和乙酰磷酸鹽顯著升高（圖4a），而NAFLD-HCC糞便中的異檸檬酸水平低于NAFLD肝硬化和非NAFLD對(duì)照（P<0.0001）。

接下來，我們使用¹H-NMR對(duì)糞便和血清樣品中的六個(gè)關(guān)鍵SCFA進(jìn)行絕對(duì)定量。與NAFLD肝硬化和非NAFLD對(duì)照相比，NAFLD-HCC受試者的糞便富含乙酸，丁酸和甲酸（圖4b），因此，這些糞便SCFA的增加是NAFLD-HCC的重要特征。但是兩組之間的糞便中丙二酸，丙酸或戊酸水平?jīng)]有顯著差異。與NAFLD肝硬化和非NAFLD對(duì)照相比，在血清中，我們確定了NAFLD-HCC中丁酸和丙酸水平升高（圖4c）。因此，這些血清SCFA的增加是NAFLD-HCC的重要特征。與非NAFLD對(duì)照相比，NAFLD-HCC和NAFLD肝硬化患者的血清丙二酸均升高，但是，NAFLD-HCC和NAFLD肝硬化組之間無(wú)差異（圖4c）。兩組之間的血清中乙酸，甲酸和戊酸水平無(wú)顯著差異。

圖4 與NAFLD-肝硬化和非NAFLD對(duì)照組相比，來自NAFLD-HCC患者的糞便和血清的一些短鏈脂肪酸(SCFA)和短鏈脂肪酸中間體水平升高

a.在NAFLD-肝硬化、非NAFLD對(duì)照和NAFLD-HCC受試者糞便樣品中短鏈脂肪酸中間體的相對(duì)定量分析。b.NAFLD-肝硬化、非NAFLD對(duì)照和NAFLD-HCC受試者糞便樣本中短鏈脂肪酸的絕對(duì)濃度。c.NAFLD-肝硬化、非NAFLD對(duì)照和NAFLD-HCC受試者血清樣本中短鏈脂肪酸的絕對(duì)濃度。

6. 體外研究表明，NAFLD-HCC微生物群引起免疫抑制反應(yīng)

在動(dòng)物和體外研究中，某些細(xì)菌和SCFA已顯示出直接促進(jìn)免疫抑制反應(yīng)的作用。因此，在表征了NAFLD-HCC受試者中的微生物群組成和相關(guān)的糞便代謝組學(xué)之后，我們的目標(biāo)是在離體細(xì)胞培養(yǎng)模型中研究微生物群對(duì)外周免疫應(yīng)答的影響。在各種刺激條件下，我們用來自每個(gè)NAFLD-HCC（n= 10），NAFLD肝硬化（n= 10）和非NAFLD的單個(gè)細(xì)菌提取物（BE）刺激了來自非NAFLD對(duì)照（n= 10）的單個(gè)外周血單核細(xì)胞（PBMC）樣品。這些BE是根據(jù)NAFLD-HCC中的α多樣性（321.8±11.53；觀察到的物種數(shù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）和NAFLD肝硬化（325.2±2.74）以及非NAFLD對(duì)照組（343.8±2.10）中大多數(shù)糞便樣本里多樣性最少的糞便樣本制備的。我們的模型產(chǎn)生了總共800個(gè)樣本和7270流式細(xì)胞儀讀數(shù)。

7.NAFLD-HCC菌群誘導(dǎo)IL-10⁺ Treg效應(yīng)物的擴(kuò)增，同時(shí)減弱細(xì)胞毒性CD8⁺ T細(xì)胞的擴(kuò)增

來自NAFLD-HCC受試者的BE誘導(dǎo)的Tregs擴(kuò)增超出了NAFLD肝硬化和非NAFLD對(duì)照中的Tregs擴(kuò)增水平（圖5a）。我們確定了這種擴(kuò)增的Treg群體的表型，并證實(shí)與非NAFLD對(duì)照BE相比，來自NAFLD-HCC受試者的BE誘導(dǎo)了效應(yīng)IL-10⁺ Treg（CD3⁺ CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ IL-10⁺ ）的擴(kuò)增，而與NAFLD-肝硬化和非NAFLD對(duì)照BE相比，來自NAFLD-HCC受試者的BE減弱了總CD8+ T細(xì)胞（CD3⁺ CD8⁺ ）的擴(kuò)增（圖5b）。我們證實(shí)該觀察結(jié)果不是細(xì)胞凋亡的結(jié)果。此外，我們觀察到來自NAFLD-HCC受試者的BE減弱了細(xì)胞毒性CD8⁺ T細(xì)胞（CD3⁺ CD8⁺ CCR7^- CD45RO^-）的擴(kuò)增，并促進(jìn)了中央記憶CD8 + T細(xì)胞（CD3⁺ CD8⁺ CCR7⁺ CD45RO⁺）的出現(xiàn)。

同樣，與NAFLD肝硬化和非NAFLD對(duì)照BE相比，來自NAFLD-HCC受試者的BE減弱了總CD4⁺ T細(xì)胞（CD3⁺ CD4⁺）的擴(kuò)增，而在T輔助細(xì)胞（Th1；CD3⁺ CD4⁺ Tbet⁺）人群中未見明顯變化。

圖5 來自NAFLD-HCC受試者的細(xì)菌提取物(BE)在非NAFLD受試者的PBMCs中誘導(dǎo)了免疫抑制表型

a.在非NAFLD對(duì)照、NAFLD-肝硬化和NAFLD-HCC組的Tregs(CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺)的Fold變化。b.CD8⁺ T cells (CD3⁺CD8⁺)的Fold變化。c.單核細(xì)胞抗原遞呈細(xì)胞(monocytes; CD3?CD14⁺)的Fold變化。d.B cells (CD19⁺CD20⁺)的Fold變化。

8. NAFLD-HCC微生物群改變了抗原呈遞環(huán)境

為了進(jìn)一步表征外周免疫反應(yīng)的變化，我們?cè)陔x體模型中測(cè)量了抗原呈遞細(xì)胞群，包括單核細(xì)胞（CD3-CD14⁺），髓樣樹突狀細(xì)胞（CD3-HLADR⁺CD11c ⁺）和B細(xì)胞（CD19⁺ CD20⁺）。與NAFLD肝硬化和非NAFLD對(duì)照BE相比，來自NAFLD-HCC受試者的BE減弱了單核細(xì)胞的擴(kuò)增（P= 0.002）（圖5c）。同樣，與NAFLD肝硬化和非NAFLD對(duì)照BE相比，來自NAFLDHCC受試者的BE減弱了B細(xì)胞的擴(kuò)增（P= 0.006）（圖5d）。

9.NAFLD-HCC微生物群引發(fā)了支持免疫抑制的細(xì)胞因子環(huán)境

研究表明IL-2和IL-12（p70）在CD8⁺ T細(xì)胞的擴(kuò)增和激活中很重要。我們觀察到，與NAFLD-HCC相比，NAFLD-HCC受試者的BE抑制了這些促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。此外，與非NAFLD對(duì)照BE相比，NAFLD-HCC和NAFLD肝硬化BE均會(huì)抑制IL-4的產(chǎn)生（圖6）。與NAFLD-肝硬化和非NAFLD對(duì)照BE相比，NAFLD-HCCBE誘導(dǎo)了IL-6和抗炎細(xì)胞因子IL-10的相應(yīng)增加（圖6）。

圖6 NAFLD-HCC患者的細(xì)菌提取物(BE)改變了促/抗炎細(xì)胞因子環(huán)境

加入非NAFLD對(duì)照，NAFLD-肝硬化和NAFLD-HCC細(xì)菌提取物（BE）后，PBMC培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子定量。樣本量為n = 10的非NAFLD對(duì)照，n = 10的NAFLD-肝硬化，n = 10的NAFLD-HCC作為生物學(xué)獨(dú)立的樣本。

10. 相關(guān)模型證實(shí)了NAFLD-HCC微生物群與丁酸和免疫抑制反應(yīng)之間的聯(lián)系

為了評(píng)估NAFLD-HCC富集物種的豐度，糞便代謝產(chǎn)物的濃度與我們離體模型中引起的T細(xì)胞反應(yīng)之間的關(guān)系我們進(jìn)行了相關(guān)分析。此外，腸道微生物與免疫反應(yīng)之間顯著的相關(guān)性與我們觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。具體來說B. caecimuris, B. xylanisolvens,和C.bolteae與IL-10⁺ Tregs效應(yīng)器正相關(guān)，而更重要的是，B.caecimuris, B. xylanisolvens,也與CD8⁺ T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，突顯了這些類群在調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫中的重要性。此外，V.parvula與Tregs正相關(guān)，但與IL-10⁺ Tregs效應(yīng)物無(wú)正相關(guān)，與CD8⁺ T細(xì)胞負(fù)相關(guān)，而R.gnavus與細(xì)胞毒性CD8⁺ T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，與Tregs或效應(yīng)IL-10⁺ Tregs卻不相關(guān)（圖7a）。

關(guān)于SCFA及其中間體，我們?cè)诙∷岷?/span>Tregs和效應(yīng)物IL-10⁺ Tregs（R= 0.69，P= 0.031）之間發(fā)現(xiàn)正相關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)支持先前的報(bào)道。體外研究表明，丁酸酯可誘導(dǎo)PBMC中的Treg群體；此外，在丁酸鹽和細(xì)胞毒性CD8⁺ T細(xì)胞之間發(fā)現(xiàn)負(fù)相關(guān)，再次凸顯了這種SCFA在調(diào)節(jié)外周免疫應(yīng)答中的重要性。我們?cè)谝阴Ａ姿猁}，草酰乙酸鹽，乙酸鹽或甲酸鹽與Tregs或CD8⁺ T細(xì)胞之間未發(fā)現(xiàn)明顯的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)（圖7b）。

圖7 NAFLD-HCC微生物群與丁酸和免疫抑制反應(yīng)之間的聯(lián)系

a.NAFLD-HCC微生物群與免疫抑制反應(yīng)之間的相關(guān)性分析。b.丁酸與免疫抑制反應(yīng)之間的相關(guān)性分析。

討論

腸道菌群及其代謝產(chǎn)物已被認(rèn)為是肝癌發(fā)展的重要輔助因素，HCC的發(fā)展正是通過腸-肝軸與免疫相互作用發(fā)生的。在這項(xiàng)研究中，我們采用了宏基因組學(xué)和代謝組學(xué)分析方法，以鑒定將NAFLD-HCC與NAFLD肝硬化區(qū)分開的微生物組的結(jié)構(gòu)和功能變化。此外，我們利用體外NAFLD-HCC細(xì)胞模型來證明該微生物群及其代謝產(chǎn)物對(duì)外周免疫的特異性作用，這個(gè)發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義。

多條證據(jù)表明腸營(yíng)養(yǎng)不良被認(rèn)為是肝硬化的重要特征之一。盡管使用了不同的對(duì)照組和不同的地理區(qū)域，但來自我們隊(duì)列和其他研究組的人類宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)仍支持NAFLD肝硬化的新出現(xiàn)的核心微生物組特征，即高豐度的R.gnavus, C. bolteae, Streptococcus parasanguinis和 Klebsiella pneumoniae，低豐度的有益菌Faecalibacteriumprausnitzii, Alistipes putredinis 和Eubacterium eligens。我們進(jìn)一步確定了V. parvula和B.caecimuris是將NAFLD-HCC與NAFLD-肝硬化區(qū)分開來的特征菌群。同樣，在我們和其他研究中，也觀察到檢測(cè)到的NAFLD肝硬化代謝物存在一些相似特征，即色氨酸向吲哚甲酸甲酯的微生物代謝增加。因此，新出現(xiàn)的數(shù)據(jù)支持了糞便微生物和代謝組學(xué)作為診斷標(biāo)記物的潛力。

至于肝癌特有的微生物特征，相關(guān)的數(shù)據(jù)正在涌現(xiàn)。與我們的發(fā)現(xiàn)一致，對(duì)NAFLD-HCC患者進(jìn)行的16SrRNA分析檢測(cè)到了擬桿菌屬和球菌科成員的富集，這與幾種全身性炎癥和免疫標(biāo)志物相關(guān)。研究人員使用16SrRNA分析對(duì)慢性乙型肝炎相關(guān)肝癌患者的糞便標(biāo)本進(jìn)行分析，能夠檢測(cè)到HCC特異性微生物標(biāo)志物，這些標(biāo)志物已在其他中國(guó)人群中成功進(jìn)行了交叉驗(yàn)證。與我們的發(fā)現(xiàn)和其他發(fā)現(xiàn)相反，Ren等在早期肝癌患者中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生丁酸鹽的細(xì)菌家族減少了，如Ruminococcus，Oscillibacter，Faecalibacterium，ClostridiumIV和Coprococcus，這些不同的發(fā)現(xiàn)可能是由于研究人群的顯著差異。在Ren等人的研究中，與我們的高BMI隊(duì)列相比，慢性乙型肝炎的感染是該研究人群潛在的肝病的病因，此外，其BMI較低。顯然，以上結(jié)果表明仍然需要在大型隊(duì)列研究中進(jìn)行充分驗(yàn)證，以確定HCC微生物組的肝臟疾病特異性改變。

我們進(jìn)一步觀察到NAFLD-HCC中的微生物組富含膳食纖維合成SCFA所需的基因，包括丙酮酸羧化酶，磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶。NAFLD-HCC患者糞便和血清中的SCFA（尤其是丁酸）及其中間體的濃度超過了NAFLD-肝硬化患者的水平，這表明NAFLDHCC中的微生物具有協(xié)同作用，從而增加了SCFA的產(chǎn)生。確實(shí)，已經(jīng)報(bào)道了肥胖的NAFLD患者的糞便SCFA水平升高，但是，我們的研究人群與BMI相匹配，因此，肥胖本身不能解釋NAFLD-HCC中SCFA濃度升高的原因，并且更可能歸因于該NAFLD-HCC患者的微生物群的分布。為了支持我們的發(fā)現(xiàn)，最近的動(dòng)物研究表明，在腸道營(yíng)養(yǎng)不良的情況下，喂食高纖維飲食的小鼠表現(xiàn)出體內(nèi)SCFA濃度升高（特別是丁酸鹽），從而促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，肝纖維化并因此促進(jìn)HCC。此外，已觀察到用萬(wàn)古霉素治療黑色素瘤動(dòng)物模型可通過消除瘤胃球菌科和鏈霉菌科成員降低SCFA濃度，從而改善對(duì)放療的反應(yīng)并減輕腫瘤負(fù)擔(dān)。這些研究推測(cè)，大量SCFA的產(chǎn)生，特別是在生物失調(diào)情況下丁酸的產(chǎn)生，可能反而會(huì)創(chuàng)造出一種促進(jìn)腫瘤的微環(huán)境。但是，與SCFA的炎癥和促進(jìn)腫瘤的潛力相反，其他研究人員發(fā)現(xiàn)，喂食高纖維飲食的小鼠的SCFA循環(huán)水平增加，并受到保護(hù)免受炎癥和癌癥的侵害。這種與SCFA相關(guān)的功能悖論支持以下觀點(diǎn)：SCFA在細(xì)胞水平上的功能取決于細(xì)胞類型和暴露量。沿著這一思路，新興文獻(xiàn)支持以下觀念：SCFA劑量增加（超過宿主可耐受的閾值）更有可能促進(jìn)組織炎癥和促腫瘤，其作用超過其任何有益作用。

在提出的離體模型中，NAFLD-HCC中的腸道菌群促進(jìn)了總的IL-10⁺ Treg和效應(yīng)子Treg的擴(kuò)增，而CD8+ T細(xì)胞的擴(kuò)增卻減少了。先前已證明某些已鑒定的NAFLD-HCC中微生物物種的菌群在調(diào)節(jié)Tregs的表達(dá)中起關(guān)鍵作用，而在結(jié)腸炎的動(dòng)物模型中，幾種梭菌菌株和R.gnavus導(dǎo)致免疫應(yīng)答偏向Treg應(yīng)答。此外，人類微生物菌群在無(wú)菌小鼠中的定殖已被鑒定出能夠誘導(dǎo)Treg以及IL-10的梭狀芽胞桿菌菌株的混合物。研究表明Treg促進(jìn)免疫耐受，Treg介導(dǎo)的細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞功能的減弱在該過程中至關(guān)重要。IL-2是CD8⁺ T細(xì)胞活化和擴(kuò)增所必需的，IL-2的Treg消耗被認(rèn)為是Treg減弱外周血CD8+ T細(xì)胞的機(jī)制。這種互逆的T細(xì)胞表達(dá)譜是由患有NAFLD-HCC但非肝硬化的患者的菌群離體引起的，這表明NAFLD-HCC菌群具有特異性的免疫調(diào)節(jié)作用。

除了上述數(shù)據(jù)外，我們的相關(guān)模型還證實(shí)了富含NAFLD-HCC糞便的代謝物丁酸與引發(fā)的T細(xì)胞反應(yīng)之間存在聯(lián)系。先前的離體研究表明，通過增強(qiáng)Foxp3表達(dá)的機(jī)制，SCFA特別是丁酸與PBMC的孵育會(huì)以濃度依賴的方式引起Treg的擴(kuò)增。我們的體外和相關(guān)模型相結(jié)合，證明了NAFLD-HCC中的病菌?。ㄎ⑸锝M和相關(guān)代謝產(chǎn)物）對(duì)T細(xì)胞反應(yīng)的集體作用。

我們還觀察到丁酸鹽與細(xì)胞毒性CD8⁺ T細(xì)胞負(fù)相關(guān)，與動(dòng)物數(shù)據(jù)一致，表明丁酸鹽可直接減弱抗原特異性CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)。與此相反，其他研究者顯示丁酸酯可增強(qiáng)CD8⁺ T細(xì)胞效應(yīng)子的功能。同樣，這表明丁酸酯的功能取決于其劑量和特定的細(xì)胞環(huán)境。

微生物群及其代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的能力與HCC主題有關(guān)。研究顯示，肝癌患者外周血中循環(huán)Treg的升高可獨(dú)立預(yù)測(cè)不良預(yù)后。同樣，由于抗腫瘤CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)的恢復(fù)，在接受全身治療的HCC患者中循環(huán)Treg水平的降低與更好的治療和疾病結(jié)局相關(guān)。最近的研究證實(shí)了腸道菌群在促進(jìn)或抑制抗癌CD8⁺ T細(xì)胞反應(yīng)中的重要性?？偟膩碚f，基于我們的發(fā)現(xiàn)和其他發(fā)現(xiàn)，可以推測(cè)腸道衍生的干預(yù)策略可能對(duì)NAFLD-HCC患者恢復(fù)CD8⁺ T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)具有治療作用。

現(xiàn)在出現(xiàn)了一個(gè)問題，即腸道微生物組和/或來自NAFLD-HCC的相關(guān)代謝產(chǎn)物如何影響外周免疫反應(yīng)。研究人員認(rèn)為，由于腸屏障功能障礙，細(xì)菌性產(chǎn)物和代謝產(chǎn)物易位于肝硬化。為此，在有或沒有HCC的NAFLD肝硬化患者的外周血中，細(xì)菌脂多糖（LPS）和腸屏障功能障礙標(biāo)志物（zonulin-1）的水平已顯示出升高。此外，研究表明，腸道菌群可以指導(dǎo)外周免疫對(duì)免疫耐受的反應(yīng)。在這方面，我們已經(jīng)在動(dòng)物模型中證明了響應(yīng)共生微生物群的Tregs的外周抗原特異性種群的產(chǎn)生，同樣，已證明外圍免疫細(xì)胞對(duì)微生物代謝產(chǎn)物（尤其是SCFA）的感應(yīng)會(huì)影響促炎和抗炎免疫細(xì)胞之間的平衡，從提出的離體模型中獲得的發(fā)現(xiàn)提供了證據(jù)，即NAFLD-HCC中的微生物群及其代謝產(chǎn)物可以將外周免疫反應(yīng)引導(dǎo)至免疫抑制表型，該表型與較差的結(jié)果相關(guān)。

但同時(shí)我們的研究也存在一些局限性。首先，從微生物組特征來看，無(wú)NAFLD或無(wú)肝硬化的代謝綜合征患者可能是更合適的對(duì)照組。結(jié)果，當(dāng)前的分析無(wú)法確定代謝變量對(duì)檢測(cè)到的微生物特征的潛在混雜影響。但是，在臨床實(shí)踐中，招募年齡適中，年齡與我們的研究隊(duì)列匹配，患有代謝綜合征而沒有NAFLD的對(duì)照組是具有挑戰(zhàn)性的。實(shí)際上，該人群中存在代謝綜合征，特別是糖尿病，大大增加了NAFLD，NAFLD纖維化和肝硬化的患病率；其次，非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析可以提供更多有價(jià)值的信息；最后，與飲食組成有關(guān)的詳細(xì)信息將是有意義的，因?yàn)樵?/span>NAFLD-HCC組中SCFA顯著增加。

綜上所述，我們已經(jīng)確定了富含NAFLD-HCC的關(guān)鍵物種，具有功能和代謝組學(xué)證據(jù)表明SCFA合成增加，從而導(dǎo)致免疫抑制反應(yīng)，而NAFLD肝硬化則未見。我們的數(shù)據(jù)支持以下觀點(diǎn)：在HCC中利用微生物組及其代謝物的知識(shí)可能有助于開發(fā)預(yù)后指標(biāo)和新的治療策略（圖8）。

圖8 NAFLD-HCC患者的微生物組和代謝組在體內(nèi)誘發(fā)了免疫抑制表型

總結(jié)關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)的模式。NAFLD-HCC的生態(tài)失調(diào)的特點(diǎn)是不同的細(xì)菌種類的豐度增加，產(chǎn)生短鏈脂肪酸的能力增加和糞短鏈脂肪酸濃度升高。肝硬化伴肝細(xì)胞癌或不伴肝細(xì)胞癌的患者常出現(xiàn)“腸漏”。NAFLD-HCC患者的微生物組和代謝組在體外誘導(dǎo)了免疫抑制表型(特征為Tregs增加，CD8⁺T細(xì)胞減少，APCs減少)，這與HCC患者的臨床結(jié)果不佳和免疫治療耐藥性有關(guān)。