編譯：冬日暖陽(yáng)，編輯：謝衣、江舜堯。

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樣本采集：對(duì)3至5歲被診斷患有哮喘的患兒和健康對(duì)照的兒童采集血漿和尿液，收集有關(guān)人口統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)、家庭特應(yīng)性史、被動(dòng)吸煙和與特應(yīng)性疾病有關(guān)的家庭收入的信息。對(duì)采集的受試者的血清樣品檢測(cè)總血清和過(guò)敏原特異性血清IgE水平。通過(guò)ImmunoCAP測(cè)量總血清IgE水平，并使用商業(yè)化的IgE測(cè)定法確定食物（蛋清和牛乳）和吸入性（Dermatophagoides pteronyssinus和Dermatophagoides farinae）過(guò)敏原的特定IgE水平。變應(yīng)原特異性IgE水平≥0.35 kU / L被定義為陽(yáng)性并表示變態(tài)反應(yīng)致敏。

代謝組分析血漿和尿液樣品制備：將500μL血漿與500μL磷酸鹽緩沖液在含有TSP的氘水溶液中混合，渦旋20 s，并在4℃以12000g離心30分鐘，取600μL上清液轉(zhuǎn)移至NMR管中進(jìn)行分析。

¹H–核磁共振（NMR）分析及數(shù)據(jù)處理：使用Bruker Avance 600 MHz光譜儀進(jìn)行，自由感應(yīng)衰減64K數(shù)據(jù)點(diǎn)，譜寬10,000 Hz，64 次掃描。然后將獲得的1H-NMR光譜進(jìn)行手動(dòng)定相，進(jìn)行基線校正，并使用TopSpin 3.2軟件將化學(xué)位移參考為TSP。導(dǎo)入NMRProcFlow軟件處理，進(jìn)行校準(zhǔn)、基線校正、對(duì)準(zhǔn)、光譜存儲(chǔ)和數(shù)據(jù)歸一化。通過(guò)使用Chenomx NMR Suite 8.1軟件鑒定代謝物。使用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）進(jìn)行分組，選擇在VIP得分上≥1.0或p值<0.05的代謝物，并利用KEGG分析功能性代謝途徑。

患者基本情況

共有54名兒童（28名哮喘病患者和26名健康對(duì)照者）參加了這項(xiàng)研究。哮喘患兒與健康對(duì)照者的特征差異見表1。特應(yīng)性指標(biāo)包括總血清IgE水平和對(duì)屋塵螨D. pteronyssinus和D. farinae的過(guò)敏原特異性IgE水平，但不包括蛋清或牛奶，哮喘患兒的患病率顯著高于健康對(duì)照組（p = 0.001）。性別、孕產(chǎn)婦年齡、母親疾病、被動(dòng)吸煙和家庭收入均無(wú)差異。

表1.本研究中調(diào)查的54名兒童的流行病學(xué)特征

根據(jù)哮喘和螨、食物和IgE敏感性分類的代謝物集

1H-NMR分析血漿和尿液獲得34種和44種已知代謝物。表2顯示了哮喘患者和對(duì)照組之間以及螨蟲、食物和IgE致敏的兒童之間具有顯著差異表達(dá)的代謝物和表達(dá)水平的倍數(shù)變化。與健康對(duì)照組相比，哮喘患兒血漿組氨酸水平明顯升高，而尿中的1-甲基煙酰胺和三甲胺N-氧化物（TMAO）的水平較低。與沒(méi)有致敏的兒童相比，IgE和食物致敏兒童分別有11（92％）的血漿代謝物和8（80％）的尿代謝物具有顯著差異。

表2.哮喘患兒和對(duì)照組以及有無(wú)螨蟲、食物和IgE致敏的患兒之間的代謝物的VIP評(píng)分和倍數(shù)變化差異顯著

血漿和尿液代謝產(chǎn)物之間的關(guān)聯(lián)

血漿和尿液代謝物之間的Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)如圖1所示。血漿焦谷氨酸、3-羥基丁酸和丙酮與大多數(shù)尿液代謝物呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)，而丙二醇呈正相關(guān)。其中，血漿3-羥基丁酸與尿液3-甲基-2-氧代戊酸、3-羥基異戊酸、2-羥基異丁酸、3-羥基異丁酸和丙氨酸高度相關(guān)。此外，血漿亮氨酸、酪氨酸和纈氨酸也與尿液中的3-羥基異戊酸、2-羥基異丁酸和丙氨酸有很強(qiáng)的相關(guān)性。對(duì)于血漿和尿液中都存在的代謝物，肌酸和賴氨酸呈負(fù)相關(guān)。

圖1.血漿和尿液代謝物之間Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)的熱圖。顏色強(qiáng)度代表相關(guān)程度。紅色=正相關(guān)；藍(lán)色=負(fù)相關(guān)。+符號(hào)表示p值<0.05；++符號(hào)表示p值<0.01

血漿和尿液代謝組間特應(yīng)性指標(biāo)相關(guān)代謝產(chǎn)物的關(guān)聯(lián)

進(jìn)一步比較血漿和尿液代謝組之間與特應(yīng)性指數(shù)相關(guān)的差異代謝產(chǎn)物的相關(guān)性，結(jié)果顯示哮喘相關(guān)血漿組氨酸與任何尿液代謝產(chǎn)物均不相關(guān)，而尿液1-甲基煙酰胺和TMAO與血漿甘露糖和賴氨酸呈強(qiáng)正相關(guān)。與血漿IgE致敏相關(guān)的纈氨酸和賴氨酸分別與2-羥基異丁酸和3-羥基異戊酸顯著負(fù)相關(guān)。相反，食物致敏相關(guān)的尿液3-甲基-2-氧代戊酸和3-羥基異丁酸分別與血漿焦谷氨酸和3-羥基丁酸呈顯著負(fù)相關(guān)

與過(guò)敏原特異性IgE水平相關(guān)的特應(yīng)性指標(biāo)相關(guān)的代謝物

血漿、尿液代謝物的特應(yīng)性指數(shù)與總血清IgE和過(guò)敏原特異性IgE水平的相關(guān)性如圖2所示?？傃?/span>IgE水平與屋塵螨D. pteronyssinus、D. farinae、蛋白、牛奶的特異性IgE水平顯著正相關(guān)（p <0.01）。其中，發(fā)現(xiàn)D. pteronyssinus和D. farinae的特異的IgE水平之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性，蛋白和牛奶中的IgE特異水平之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性，但螨蟲和食物過(guò)敏原的IgE特異水平之間卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)性。但是，與IgE致敏有關(guān)的血漿代謝物與總血清IgE和過(guò)敏原特異性IgE水平無(wú)關(guān)。相反，大多數(shù)與食物敏感性相關(guān)的尿液代謝產(chǎn)物與總血清IgE和蛋清特異性IgE水平顯著正相關(guān)（p <0.05）。此外，與哮喘相關(guān)的尿液TMAO與賴氨酸和蛋氨酸顯著相關(guān)，而尿液1-甲基煙酰胺與乙酸和乳酸顯著相關(guān)。

代謝途徑與功能分析

與過(guò)敏致敏有關(guān)的代謝功能途徑見表3。與健康對(duì)照相比，過(guò)敏兒童的血漿糖酵解或糖原異生與丙酮酸代謝和尿液氨基酸代謝顯著相關(guān)。在血漿丙酮酸代謝中發(fā)現(xiàn)丙酮酸和乳酸水平降低，同時(shí)乙酸水平升高。分別在尿液纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解途徑和苯丙氨酸代謝中發(fā)現(xiàn)亮氨酸、纈氨酸和3-羥基異丁酸水平升高，3-苯基丙酸酯、N-苯基乙?；拾彼岷屠野彼崴缴?。

表3.與兒童哮喘過(guò)敏致敏有關(guān)的代謝物的代謝途徑和功能分析

利用代謝譜分析已成功鑒定出某些代謝產(chǎn)物與哮喘有關(guān)。但是，不同的疾病狀態(tài)的樣本類型具有獨(dú)特的代謝特征。本文提供了兒童哮喘的血漿和尿液的綜合。

通過(guò)人體循環(huán)的血液攜帶著許多小分子代謝物，這些代謝物是由生物體和外源性化學(xué)物質(zhì)（包括藥物、食品和環(huán)境過(guò)敏）產(chǎn)生的。而腎臟在從血液中提取水溶性廢物以及各種其他過(guò)量化合物，產(chǎn)生尿液。結(jié)合蛋白的代謝物可能無(wú)法通過(guò)腎小球完全濾除，并且活躍的腎小管分泌和再吸收也可能影響尿液中代謝物的水平。這可能是本研究中血漿和尿液中都存在代謝產(chǎn)物之間沒(méi)有強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)的原因。

3-羥基丁酸是由乙酰輔酶A在肝臟中合成的脂肪酸和生酮氨基酸（如亮氨酸和異亮氨酸）的代謝產(chǎn)物。在這項(xiàng)研究中，觀察到血漿3-羥基丁酸與尿液中的羥基酸之間存在強(qiáng)而顯著的相關(guān)性。

與之前研究相同，本研究中總血清IgE水平與螨蟲和食物的特定IgE水平密切相關(guān)。但在血漿中，大多數(shù)差異代謝物是在IgE致敏的兒童中發(fā)現(xiàn)的。觀察到乙酸和纈氨酸水平升高的同時(shí)血漿丙酮酸通過(guò)乙酰輔酶A代謝，可能在對(duì)過(guò)敏反應(yīng)的血清IgE產(chǎn)生中起作用。

與血漿相比，食物致敏的兒童尿液代謝物顯著差異，并且與總血清IgE水平相關(guān)，表明尿液代謝組可能主要反映營(yíng)養(yǎng)狀況、飲食攝入和過(guò)敏結(jié)果。此外，與食物致敏有關(guān)的尿液代謝物3-羥基異丁酸和3-甲基-2-氧代戊酸分別是纈氨酸和異亮氨酸代謝的中間產(chǎn)物。本研究中尿液中纈氨酸、亮氨酸和羥酸水平的增加表明支鏈氨基酸代謝可能會(huì)影響對(duì)食物的過(guò)敏反應(yīng)。

代謝組學(xué)分析和尿液樣品分析已成功鑒定出與哮喘相關(guān)的微生物衍生代謝物。本研究中，尿液TMAO是腸道細(xì)菌產(chǎn)生的代謝物，與食物過(guò)敏和兒童哮喘有關(guān)。此外，尿液中N-苯基乙酰甘氨酸是一種腸道微生物的協(xié)同代謝物，與總血清IgE水平和食物過(guò)敏原特異性IgE水平密切相關(guān)。因此，利用飲食依賴的代謝途徑對(duì)腸道菌群的營(yíng)養(yǎng)不良可能是確定人類患過(guò)敏性疾病敏感性的關(guān)鍵。

組氨酸是一種必需氨基酸，可產(chǎn)生組胺，而組胺在哮喘患者的急性過(guò)敏反應(yīng)中起著重要作用。相反，飲食中煙酸的代謝產(chǎn)物1-甲基煙酰胺與哮喘以及血漿甘露糖密切相關(guān)。甘露糖結(jié)合凝集素是先天免疫中的重要蛋白質(zhì)，在結(jié)合甘露糖后調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，并通過(guò)引起氣道炎癥與哮喘有關(guān)。據(jù)報(bào)道1-甲基煙酰胺對(duì)哮喘加重具有保護(hù)作用，其可能的機(jī)制其與甘露糖結(jié)合凝集素水平有關(guān)的抗炎作用相關(guān)。

代謝組學(xué)可用于識(shí)別參與調(diào)節(jié)哮喘的復(fù)雜機(jī)制的生物標(biāo)志物和途徑。本研究的主要局限性是使用¹H-NMR時(shí)相對(duì)較小的樣品量和對(duì)豐度較低的代謝物（<100 nmol/L）靈敏度低。但¹H-NMR具有高重現(xiàn)性。最重要的是，血漿和尿液代謝組的綜合分析可提供有關(guān)過(guò)敏性疾病的更全面的代謝信息。

通常使用血漿和尿液代謝組學(xué)評(píng)估導(dǎo)致人類疾病的分子機(jī)制。尿液通常包含來(lái)自多種食品和藥物的代謝分解產(chǎn)物，而血液包含代謝活性化合物和尿中不存在的脂溶性代謝產(chǎn)物。本文對(duì)兒童哮喘的血液和尿液中代謝反應(yīng)進(jìn)行綜合分析，反映出在過(guò)敏反應(yīng)中不同的代謝途徑，血漿中能量代謝和氨基酸代謝似乎與血清IgE有關(guān)，而尿中支鏈氨基酸的代謝主要反映了食物過(guò)敏反應(yīng)。檢測(cè)到的的食物致敏有關(guān)的微生物-宿主共代謝物也表明腸道微生物營(yíng)養(yǎng)不良對(duì)過(guò)敏的影響。但更全面的解析這種關(guān)聯(lián)仍需要進(jìn)行進(jìn)一步的功能研究。

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