【原】提供小鼠體內(nèi)利用海腎熒光素酶基因標(biāo)記肝癌細(xì)胞生物發(fā)光成像的應(yīng)用（含圖示）

昵稱iP7Xa 2021-03-08

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海腎熒光素酶( renilla luciferase,Rluc)是一種真核表達(dá)的熒光素酶,具有特異性底物腔腸素( coelenterazine ),Rluc的信號(hào)分子活性在腹腔注射底物coelenterazine 1 min內(nèi)達(dá)到高峰。Rluc敏感性高、代謝速度快,可用于標(biāo)記腫瘤細(xì)胞。本研究采用Rluc標(biāo)記肝癌細(xì)胞,利用活體成像進(jìn)行系統(tǒng)直觀、定量監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移情況。

具體標(biāo)記方法：

1.構(gòu)建Rluc基因標(biāo)記的Rluc-GFP-Hepa1-6細(xì)胞:(1）慢病毒包裝。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK-293細(xì)胞,每10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)接種6×10°個(gè)細(xì)胞,37℃、5%CO,的培養(yǎng)箱過(guò)夜。12 h后移去培養(yǎng)液,將Packaging Mix 、慢病毒質(zhì)粒及Lipofectamine 2000與Opti-MEM培養(yǎng)基混勻后,室溫靜置20 min后轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞。孵育6 h后更換含10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基,48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，2 000×g離心10 min去除細(xì)胞和碎片。將病毒原液50 000 ×g離心2h后棄去上清,用Opti-MEM培養(yǎng)基重懸,測(cè)定滴度后分裝并保存于-80 °℃。(2）慢病毒活性滴度測(cè)定。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK-293細(xì)胞,96孔板內(nèi)接種8 000個(gè)細(xì)胞,37℃、5%CO的培養(yǎng)箱過(guò)夜。培養(yǎng)基中加2%胎牛血清及8 ug/ml 的聚酰胺,混合均勻后備用。將慢病毒原液用DMEM培養(yǎng)基(含2%胎牛血清和8 ug/ml 聚酰胺）按10倍比稀釋,各取慢病毒稀釋液100 ul感染96孔板中的HEK-293細(xì)胞。96 h后統(tǒng)計(jì)表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)量,病毒滴度為各孔中表達(dá)GFP的細(xì)胞平均數(shù)/每孔慢病毒液體積。(3）慢病毒感染Hepa1-6細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hepa1-6細(xì)胞,6孔板內(nèi)每孔接種1×10°個(gè)細(xì)胞,37°℃、5%CO,的培養(yǎng)箱過(guò)夜。將慢病毒按病毒滴度=20加入各孔,72 h后置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞GFP表達(dá)情況。

2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)及分選:利用流式細(xì)胞儀，以GFP為分選標(biāo)記,GFP激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為507 nm。分選陽(yáng)性細(xì)胞,多次傳代后將

Rluc-GFP-Hepal-6 細(xì)胞置于激光共聚焦顯微鏡下拍照

3.生物發(fā)光成像:( 1）細(xì)胞生物發(fā)光成像。取分選后的 Rluc-GFP-Hepa1-6 細(xì)胞,24孔板內(nèi)分別接種1×10°、5 x 105、2.5 ×105、1.25 ×103、6.25 ×10*、3 ×10*個(gè)細(xì)胞,37℃ 、 5%CO,的培養(yǎng)箱過(guò)夜。24 h后棄上清,分別加入coelenterazine 0.5 ul,進(jìn)行生物發(fā)光成像,曝光時(shí)間為5 s。分析生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)量間相關(guān)性。(2）活體生物發(fā)光成像。取1×10的 Rluc-GFP-Hepal-6細(xì)胞與100 ul PBS混勻制備細(xì)胞懸液。常規(guī)消毒后,將細(xì)胞懸液接種于裸鼠左側(cè)背部皮下,皮下移植瘤的生長(zhǎng)潛伏期約7 d。分別在接種后第8、13、18、23、28 d,經(jīng)腹腔注射150 ul coelenterazine ( 30 mg/ml ）后,立即進(jìn)行活體生物發(fā)光成像。此外,游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)徑( a）和最短徑（ b ),腫瘤體積(v)=1/2 x ab2。測(cè)量至28 d,并觀察裸鼠皮下腫瘤是否存在不同程度壞死。探討皮下腫瘤的發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度與腫瘤體積的相關(guān)性。

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)量及腫瘤體積間關(guān)系采用線性回歸分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

一. 構(gòu)建并分選 Rluc-GFP-Hepa1-6細(xì)胞株慢病毒滴度為9.75× 107TU/ml,按慢病毒滴度=20感染 Hepal-6 細(xì)胞,72 h后熒光顯微鏡下可見(jiàn) GFP表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示GFP陽(yáng)性率為15% ,經(jīng)分選后獲得陽(yáng)性率高達(dá)95%的 Rluc-GFP-Hepa1-6細(xì)胞,激光共聚焦顯微鏡下Rluc-GFP-Hepa1-6細(xì)胞可表達(dá)綠色熒光（圖1)。

圖1Rluc-GFP-Hepa1-6 細(xì)胞的鑒定圖示

a為流式細(xì)胞儀分選后的Rluc-GFP-Hepa1-6細(xì)胞;b為激光共聚焦顯微鏡下表達(dá)綠色熒光的Rluc-GFP-Hepal-6細(xì)胞(×400)

二、生物發(fā)光成像

細(xì)胞生物發(fā)光成像結(jié)果顯示,Rluc-GFP-Hepa1-6細(xì)胞發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)量間有相關(guān)性(R=0.999,圖2)。

圖2不同濃度的 Rluc-GFP-Hepa1-6 細(xì)胞生物發(fā)光成像圖示

活體生物發(fā)光成像結(jié)果顯示,裸鼠皮下接種Rluc-GFP-Hepal-6 細(xì)胞后第8 d,其左側(cè)背部發(fā)光區(qū)域約16 mm',光信號(hào)強(qiáng),光子量為4.0×10° Ph/s。隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng),腫瘤體積逐漸增大,其發(fā)光信號(hào)也逐漸增強(qiáng),皮下腫瘤的發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度與腫瘤體積存在正相關(guān)性（R=0.887,圖 3 )。在接種Rluc-GFP-Hepal-6 細(xì)胞后28 d時(shí),由于裸鼠的皮下腫瘤發(fā)生壞死,盡管腫瘤體積可達(dá)1784 mm',但其生物發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度變化不大甚至出現(xiàn)下降（圖3 )。

裸鼠皮下接種 Rluc-GFP-Hepa1-6 細(xì)胞后的活體生物發(fā)光成像圖示

活體生物發(fā)光成像技術(shù)廣泛應(yīng)用于腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、基因治療,以及干細(xì)胞示蹤等相關(guān)研究。與傳統(tǒng)熒光成像相比,活體生物發(fā)光成像技術(shù)具有更高的敏感度及特異度,其在動(dòng)物體內(nèi)能檢測(cè)到低至10個(gè)細(xì)胞,而傳統(tǒng)熒光成像只能檢測(cè)到10個(gè)細(xì)胞。

活體生物發(fā)光成像技術(shù)能檢測(cè)到疾病動(dòng)物模型中肉眼不可見(jiàn)的微小病灶和淺表臟器（如肝、脾、肺)病灶,進(jìn)行安全、無(wú)創(chuàng)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),能準(zhǔn)確反映腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)際情況。同時(shí),活體生物發(fā)光成像技術(shù)以動(dòng)物自身為對(duì)照追蹤腫瘤生長(zhǎng)變化,不僅節(jié)約成本,而且可有效排除個(gè)體間差異的影響,為研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展和抗腫瘤藥效動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了科學(xué)準(zhǔn)確的依據(jù)。

生物發(fā)光成像需要反應(yīng)環(huán)境中活性氧及ATP參與,只有活細(xì)胞內(nèi)熒光素酶才能發(fā)光,因此熒光素酶常應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞的生物發(fā)光成像研究。在本研究中,結(jié)合目前常用的螢火蟲(chóng)熒光素酶( firefly luciferase, Fluc ),我們選取了Rluc基因標(biāo)記肝癌 Hepal-6 細(xì)胞,制備腫瘤模型從而動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況。在同一實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)。Rluc 、Fluc分別具有其各自特異的底物coelenterazine 、D-luciferin,不存在交叉干擾情況,而且這兩種熒光素酶的活性動(dòng)力學(xué)不同。因此,基于以上特點(diǎn),Fluc可標(biāo)記抗腫瘤靶向藥物,與 Rluc能夠在同一個(gè)動(dòng)物體內(nèi)分別進(jìn)行生物發(fā)光成像,監(jiān)測(cè)抗腫瘤靶向藥物與腫瘤的相互作用及療效。

我們成功構(gòu)建了Rluc基因標(biāo)記的小鼠肝癌細(xì)胞Rluc-GFP-Hepa1-6。通過(guò)細(xì)胞生物發(fā)光成像驗(yàn)證,Rluc-GFP-Hepa1-6的細(xì)胞數(shù)量與發(fā)光信號(hào)間具有正相關(guān)性（R'=0.999 )。隨后,將 Rluc-GFP-Hepa1-6細(xì)胞接種于裸鼠背部皮下,結(jié)合活體生物發(fā)光成像對(duì)裸鼠皮下腫瘤早期微小病灶進(jìn)行觀察，并對(duì)腫瘤生長(zhǎng)情況進(jìn)行無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),皮下腫瘤的發(fā)光信號(hào)與腫瘤體積存在良好的線性關(guān)系(R2=0.887 ),為進(jìn)一步了解活體動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展情況提供了參考依據(jù)。此外,伴隨腫瘤生長(zhǎng),部分腫瘤組織發(fā)生了出血、壞死等情況,發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度與腫瘤體積的變化相分離。

皮下腫瘤生物發(fā)光模型的建立為我們下一步建立原位腫瘤模型奠定了基礎(chǔ),我們將可通過(guò)肝內(nèi)移植腫瘤細(xì)胞,建立原位肝癌模型,利用活體生物發(fā)光成像技術(shù)檢測(cè)其生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度,動(dòng)態(tài)、定量監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況。

綜上所述,應(yīng)用Rluc生物發(fā)光成像可成功監(jiān)測(cè)小鼠肝癌皮下腫瘤模型的演進(jìn)過(guò)程,不僅為肝癌體內(nèi)生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、治療提供了理想的模型,而且為進(jìn)一步研究肝癌治療效果提供了良好、無(wú)創(chuàng)的定量示蹤手段。

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