每個角落、每個時刻都在上演著微生物的故事。今天的佳作推薦是在廢水處理的反應(yīng)器中微生物的故事，一起來探究這是一部“宮斗劇”還是“偶像劇”。

多組學(xué)分析揭示單級硝化厭氧氨氧化反應(yīng)器運行模式和微生物互作對微生物群落的影響

Exploring the effects of operational mode and microbial interactions on bacterial community assembly in a one-stage partial nitritation anammox reactor using integrated multi-omics

作者：Yulin Wang, Qigui Niu, Xu Zhang et al.

期刊：Microbiome

時間：2019-8

IF：9.86

一、研究背景

在使用局部硝化厭氧氨氧化(partial-nitritation anammox，PNA)反應(yīng)器進(jìn)行廢水脫氮處理時，厭氧氨氧化菌（AOB）的代謝能力以及與其關(guān)聯(lián)的微生物互作發(fā)揮了重要功能，但有關(guān)非生物和生物因素如何塑造PNA反應(yīng)器微生物群落結(jié)構(gòu)的報道還很缺乏。

二、實驗設(shè)計

1、 反應(yīng)器運行：在1.6 L實驗用PNA反應(yīng)器中接種氧氨氧化微生物并進(jìn)行培養(yǎng)。

2、 采樣及核酸的提取、測序及分析：于特定反應(yīng)周期及反應(yīng)器的特定位點取樣（圖1），在Illumina Hiseq 4000平臺分別進(jìn)行16S rRNA、DNA和RNA高通量測序。將質(zhì)控后的16S rRNA reads聚類成OTU并比對SILVA數(shù)據(jù)庫；質(zhì)控后的宏基因組reads進(jìn)行de novo組裝，復(fù)原微生物基因組（metagenome-assembled genomes，MAGs）并進(jìn)行注釋；將非rRNA reads回貼到預(yù)測ORFs上，分析轉(zhuǎn)錄本差異。

3、 蛋白提取和質(zhì)譜分析：采集第261天的污泥樣品（圖1），提取蛋白并用質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。

  三、結(jié)果及討論

1、單級反應(yīng)器性能?

將厭氧氨氧化污泥放入PNA反應(yīng)器中培養(yǎng)。在75天時觀察到除氮性能下降，因此于40天時調(diào)整反應(yīng)器參數(shù)。經(jīng)2個月的恢復(fù)，除氮率從150.5 mgN/L/day升高到307.5 mgN/L/day并達(dá)到一個新的穩(wěn)定期。在150天左右污泥自發(fā)聚集成顆粒狀，說明微生物分泌了比初期（1天）更多的胞外聚合物。在204天、2010天和213天時，需氧階段的氨鹽下降速率比厭氧階段的快（圖1），而氨氧化產(chǎn)物-亞硝酸鹽的積累并沒有顯著增加，說明此時氨氧化菌的除氮效率高。

2、細(xì)菌群落演替

16S rRNA測序結(jié)果表明細(xì)菌群落變化明顯。浮霉菌門的相對豐度在I期有所下降，而在III期則增加了將近2倍。優(yōu)勢物種從Kuenenia屬變成了Brocadia屬。相對豐富＞0.3%的OTUs可聚類為3大類（圖2a）。亞硝酸鹽氧化菌（nitrite-oxidizing bacteria，NOB）的平均相對豐度為0.06%，幾乎無法檢測，說明反應(yīng)器的運行模式顯著降低了NOB與氨氧化菌競爭亞硝酸鹽的能力。

 從204天、210天和213天的宏基因組數(shù)據(jù)中成功構(gòu)建了49個MAGs，它們代表了反應(yīng)器中最活躍的細(xì)菌類群。有86.1%的轉(zhuǎn)錄組reads可以比對到MAGs上。從種泥中組裝出24個MAGs，9個為種泥特有，但能比對上這9個MAGs的轉(zhuǎn)錄組reads序列不足0.5%?？傊?，這58個MAGs代表了在厭氧氨氧化污泥中的主要組成群落。

新組裝的MAGs表明了物種的相對豐度產(chǎn)生了變化（圖2b）。主要在種泥中出現(xiàn)的AMX3（氨氧化菌的一種）在SBR運行約200天后幾乎無法再檢測到，相反，種泥中的低豐度細(xì)菌（包括AOB1（該研究中作者通過組裝發(fā)現(xiàn)了三種新的AOB，分別命名AOB1、AOB2和AOB3）和AMX1）卻在此時占優(yōu)。18個MAGs的豐度始終很低（＜0.5%）。

如圖3的基因組進(jìn)化樹所示，我們從氨氧化污泥中組裝出3個氨氧化MAGs和3個AOB的MAGs。大多數(shù)MAGs都擁有高質(zhì)量基因組（完整性＞90%，污染率＜5%），且這些細(xì)菌門在氨氧化系統(tǒng)中廣泛存在。

  3、氮代謝是最活躍的細(xì)菌活動

在PNA反應(yīng)器的SBR運行模式下，新發(fā)現(xiàn)的2個氨氧化菌AMX1和AMX2的代謝活動最為活躍，它們貢獻(xiàn)了超過66%的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（圖4a），261天的樣品中氨氧化菌的蛋白達(dá)到了總量的81.1%（加權(quán)）和82.9%（非加權(quán)）。在第二活躍菌群AOB中，氮代謝蛋白是其他代謝蛋白的一百多倍（圖4c）。這些數(shù)據(jù)說明氮代謝是最重要的細(xì)菌活動。

  在厭氧和需氧階段，只有約1%的基因存在轉(zhuǎn)錄差異（圖 5）。與其他氮代謝途徑相比，氨氧化代謝基因的轉(zhuǎn)錄水平最高、蛋白表達(dá)活動最強(qiáng)烈（圖5ab）。AMX1和AMX2的聯(lián)氨合酶HZS占了氨氧化菌氮代謝約80%的蛋白總量。在優(yōu)勢物種AOB1中，編碼銨單氧酶AMO的3個亞基的基因表達(dá)活躍，而含銅亞硝酸還原酶CuNiR的表達(dá)特別活躍，且在需氧階段顯著提高（圖 5c）。

  一些沒有固氮代謝途徑的微生物能轉(zhuǎn)錄或部分轉(zhuǎn)錄反硝化代謝相關(guān)基因（圖 5c）。豐度最高的異養(yǎng)菌ARM1能表達(dá)和翻譯呼吸硝酸還原酶NarGH和細(xì)胞色素c亞硝酸還原酶NrfH，說明這種微生物進(jìn)行無氧呼吸時可以利用硝酸/亞硝酸鹽作為電子受體。氮氧化物主要由大量編碼一氧化氮還原酶Nor的AOB降解。

4、大量異養(yǎng)生物對電子供體的偏好隨著氨氧化菌的轉(zhuǎn)移而改變

在PNA反應(yīng)器中，豐度＞1%的主要是反硝化菌，它們可以用亞硝酸鹽、硝酸鹽和氣態(tài)氮氧化物作為電子受體，進(jìn)行無氧呼吸（圖5c）。我們推測，在沒有氮源的情況下，異養(yǎng)生物將和作為電子供體的AOB/氨氧化菌發(fā)生密切互作。

5、大量異營養(yǎng)缺陷型造就核心細(xì)菌群落組成

反應(yīng)器中大多細(xì)菌是營養(yǎng)缺陷型，因此氨基酸、微生物等也會影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。AMX1和AMX2是幾乎可以合成所有氨基酸的原養(yǎng)菌（圖6）。但在氨氧化MAGs中未檢測到任何編碼參與蛋氨酸合成的半胱氨酸裂解酶或半胱氨酸合酶基因，而AOB1高度表達(dá)這兩個基因，說明氨氧化菌能從AOB的代謝中獲利。

長期運行反應(yīng)器后，豐度最高的異養(yǎng)菌是營養(yǎng)缺陷型，它們比其他豐度低的異養(yǎng)菌需要更多的氨基酸，卻缺失大量的氨基酸合成基因，且通?；虮磉_(dá)量也低于其他微生物（圖6）。例如CFX需要更多種類的胞外氨基酸，在CFX1和ARM1中膜轉(zhuǎn)運基因表達(dá)最活躍的一類。而某些低豐度菌中有多類氨基酸合成基因，一些基因甚至高度表達(dá)（圖6）。在幾種優(yōu)勢異養(yǎng)菌中，維生素B合成途徑也存在缺失。實驗證明，MAGs缺失泛酸合成關(guān)鍵基因，說明氨氧化菌所需的胞外泛酸鹽依賴其他細(xì)菌產(chǎn)生，而長時間的SBR運作后，氨氧化菌是唯一能夠生產(chǎn)VB12的核心微生物。

經(jīng)過長時間處理，豐度最高的異養(yǎng)菌PLA1得到富集，而膜轉(zhuǎn)運基因的表達(dá)并不活躍，說明PLA1已經(jīng)發(fā)展了其他適應(yīng)策略：大量表達(dá)分泌基因。在PLA1與其他細(xì)菌競爭時，這些基因發(fā)揮了重要作用。

以上研究結(jié)果證實，舍棄高耗能的氨基酸合成及膜轉(zhuǎn)運過程，優(yōu)勢異養(yǎng)菌能有更強(qiáng)的適應(yīng)能力。

四、小結(jié)與亮點

本研究運用多種組學(xué)，探索了PNA反應(yīng)器微生物在生物和非生物脅迫條件下的群落組成和演替，找到了各反應(yīng)周期的優(yōu)勢微生物及組裝了它們的基因組；研究還結(jié)合微生物基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)情況，揭示了營養(yǎng)缺陷型群落在反應(yīng)器中的適應(yīng)機(jī)制，說明微生物之間有著密切的互作，為未來的污水處理提供了研究依據(jù)。