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譯者想說最近一段時間，就根際，植物同微生物的相互作用，這塊大蛋糕正在不管有人去關(guān)注，并拿起了勺子，相信在未來幾年中，隨著各種技術(shù)的不斷成熟，試驗條件的不斷優(yōu)化，我們可以看到更多的植物同微生物相互作用的優(yōu)秀文章。關(guān)于土壤記憶，土壤遺產(chǎn)，或者說，植物土壤的微生物的反饋。我已經(jīng)關(guān)注了并解讀了第三篇文章了。這三篇文章關(guān)注的略有不同，第一篇關(guān)注細菌葉部病原菌入侵植物，根際微生物會保存記憶并影響后續(xù)植物對病原菌的響應。突出這一響應是通過改變微生物群落來作用一植物的。是通過改變植物ISR過程來影響植物響應病原菌入侵的。第二篇文章ISME，也是關(guān)注真菌病原菌入侵下，植物對土壤的改變會通過微生物反饋給后代植物，同樣是土壤記憶或者遺產(chǎn)，但是第二篇文章使用的是寄生式真菌作為病原菌研究對象，不同于第一篇文章（使用葉部細菌病原菌為研究對象）。同時第二篇文章做了培養(yǎng)組學的內(nèi)容，從純菌的角度驗證植物招募有益微生物并協(xié)助抵御植物病害。而這第三篇，也就是今天的這一篇將尺度置于輪作和連坐這兩種農(nóng)業(yè)耕作措施上來。解釋的是歷史作物對當代作物的土壤遺產(chǎn)。但同前兩篇文章均關(guān)注土壤記憶效應，并且不同的作者均將其歸納為根系分泌物的遺留效應，似乎都承認根系分泌物的遺留效應使用過改變土壤微生物群落間接作用于后代植物的。而本文更進一步希望后續(xù)研究關(guān)注根系根系分泌物中化感物質(zhì)的調(diào)控作用（microbiome關(guān)注根系分泌物中有機酸和氨基酸的調(diào)控作用）。所以我們最起碼在目前肯定的是，根系分泌物是調(diào)控土壤記憶的只要力量，不同根系分泌物可能在不同土壤記憶中起著調(diào)控作用。 摘要與根系相關(guān)的微生物被認為是植物的第二基因組，他們幫助植物獲取營養(yǎng)、生產(chǎn)生長激素和抵御疾病。我們猜想，由于作物從土體土壤中招募根際微生物，而農(nóng)耕會引起土體（不受植物根系影響的土壤）土壤微生物群落組成的變化，從而影響根際微生物群落。在本研究中，我們對了不同農(nóng)藝管理、連坐和輪作土壤中生長的花生植株根系進行了轉(zhuǎn)錄組測定，并使用鳥槍法對根際微生物進行宏基因組測定分析。我們發(fā)現(xiàn)土壤耕作歷史對花生招募根際微生物群落都有著顯著影響，這表明土壤存在記憶效應。連作會減少土壤根際微生物的多樣性，也會富集一些稀有物種，同時對植物代謝過程產(chǎn)生影響，如使營養(yǎng)物質(zhì)代謝和植物激素生物合成功能衰退。連作通過影響生長素素和細胞分裂素 等基因的下調(diào)，脫落酸(abscisic acid)、水楊酸(salicylic acid)、茉莉酸(jasmonic acid)和乙烯(ethylene ))等基因的上調(diào)使花生生長受到影響，植株矮小。這些結(jié)果表明土壤利用方式會影響根際微生物和植物表型。 引言土壤微生物群落是植物吸收營養(yǎng)、生長發(fā)育以及植物抵抗病害過程的重要參與者。然而，農(nóng)藝活動可驅(qū)動土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變，從而使其適應來自植物的生物或非生物的脅迫。這表明除草劑以及農(nóng)藥的應用或農(nóng)耕過程都可能使土壤微生物群落結(jié)構(gòu)以及植株表型發(fā)生改變。連坐與輪作相比，前者微生物群落的多樣性更低。但連坐帶來的影響不一定都是負面的，它可以使病原菌的種類單一化，同時也可招募拮抗菌。但是，對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)是如何影響微生物群落裝配的，我們知之甚少。因此，我們應該重點了解根際微生物對作物功能的驅(qū)動作用。植物將自身通過光合作用固定的5—21%碳輸送到根部。因此，雖然土體土壤存在的可利用有機物質(zhì)較少，但是根際卻是微生物活動的熱區(qū)。不同植物會招募不同的根際微生物群落，這很大的原因是因為根系沉積物不同。例如，添加香豆酸(p-coumaric acid：根系分泌物)會改變黃瓜幼苗的根際微生物的結(jié)構(gòu)和組成。此外，基于同位素探針的研究結(jié)果表明，植物光合作用所合成的碳源會直接被特定的根際微生物群落利用。因此，我們假設(shè)連續(xù)在同一塊天田地種植同種作物會選擇性的富集并放大同一種微生物群落。微生物群落影響植物許多功能，例如對營養(yǎng)的吸收能力，生長激素的分泌，對病害的抵御等。通過對植物同微生物間的互相影響研究發(fā)現(xiàn)，植物通過多種方式響應根際微生物群落。最近的一項研究指出，花生根際微生物的變化對花生表型生理變化及后續(xù)生長會產(chǎn)生顯著影響。在本研究中，我們旨在解釋和聯(lián)系作物的耕作歷史對花生根際微生物群落以及花生表型的影響?；ㄉ仓攴N植在有著不同耕作歷史的土壤中(連坐和輪作)進行，花生的根際微生物群落的評估使用鳥槍法測序，植物根系功能的變化通過轉(zhuǎn)錄組測定。 結(jié)果1. 連作和輪作對花生根際微生物群落組裝影響不同Differential assemblage of rhizosphere microbial communities in monocropped and rotation soils我們分析了不同耕作制度下花生根際微生物群落的宏基因組。首先使用Bray-Curtis距離比較了群落的組成和功能差異。連作與輪作的花生根際微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能不同(補充圖S2a，圖2a)。此外，Shannon指數(shù)表明連作花生根際微生物得多樣性要低于輪作花生根際微生物的多樣性 (p<0.05, 圖2b)。變形菌門(Proteobacteria)在根際細菌群落中占據(jù)主導地位(占據(jù)全部read的62.3–74.3%，補充圖.S3a)。與輪作相比，花生連作降低了γ變形菌門(Gammaproteobacteria)(F1,5 =49.7, p=0.002)和β變形菌門(Betaproteobacteria) (F1,5 =40.3, p=0.003)豐度。而連坐花生根際的Deltaproteobacteria門(F1,5 =325.6, p<0.001)的相對豐度略有增加(1倍)。連坐花生根際酸性細菌的數(shù)量明顯少于輪作花生(F1,5= 482.9, p<0.001)，而放線菌(Actinobacteria)為(F1,5 =73.5, p=0.001),擬桿菌門( Bacteroidetes)(F1,5 =145.3, p<0.001), 厚壁菌門(Firmicutes)(F1,5 =535.7, p<0.001), 綠彎菌門(Chloro?exi)(F1,5 =1218.5, p< 0.001), and疣微菌門 (Verrucomicrobia)(F1,5 =691.3, p<0.001)等在輪作體系花生根際豐富更高。兩個最豐富的真菌門，子囊菌門(Ascomycota)(占所有真菌序列的76%)和擔子菌門(Basidiomycota)(占所有真菌序列的13%)的豐度也存在顯著差異。(補充圖S3b)。古菌(Archaea)豐度在連作花生根際明顯高于輪作，古菌門Thaumarchaeota得到明顯富集(補充圖3c)。
在屬水平上進行深入分析，根據(jù)群落中細菌的相對豐度不同，我們按照優(yōu)勢屬(>1%)、一般屬(0.1-0.1%)和稀有屬(<0.1%)進行分類。分析表明，除了 Bordetella (F1,5 =129.5, p<0.001)和伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)(F1,5=208.0, p<0.001)在連作花生根際明顯富集外(圖2c)，輪作和連作對其他花生根際優(yōu)勢屬的影響并不明顯(倍數(shù)變化<1)。在一般屬中，Ktedonobacter屬(F1,5 =575.8, p<0.001)在連作花生根際富集了10倍以上，而其他屬沒有明顯變化(倍數(shù)變化<1)。在花生根際中，超過35個稀有屬的豐度提高了5倍以上，并且超過150個稀有屬的豐度提高了2倍以上(圖2c)。從OTU水平上的分析表明，連作花生富集了一些稀有屬，并且比輪作花生的細菌豐度高了10倍，這些屬分別為ktedonobacter racemifer、Opitutus terrae、icrobium roseum、Chloroflexus aggregans、Thermosediminibacter oceani以及Dehalogenimonas lykanthropoens。在連坐花生根際中，Colletotrichum、Rhizoctonia、Rhizophagus和Dactylellina均占有很高的比例。相比之下,輪作花生根際的Penicillium、Aspergillus、Fusarium、Trichosporon的相對豐度顯著均高于連作花生根際(p <0.05)。 連坐和輪作的根際代謝功能不同Differences in abundances of metabolic functions in the rhizosphere metagenomes of monocropped and rotation soils一些代謝通路在連作與輪作根際中有很大差異。(補充表S5)。在連作花生根際富集的通路主要有：KEGG orthologs for bacterial chemotaxis (F1,5=114.3, p<0.001), sphingolipid metabolism (F1,5 =72.0, p=0.001), inositol phosphate metabolism (F1,5 =98.0, p=0.001), starch and sucrose metabolism (F1,5=283.5, p<0.001), nucleotide excision repair (F1,5 =588.0, p<0.001), phenylpropanoid biosynthesis (F1,5 =60.5, p=0.001), glycan degradation (F1,5 =36.1, p=0.004), and fructose and mannose metabolism (F1,5 =108.0, p<0.001) (補充圖S2b)。相反，連作花生根際的 lipopolysaccharide biosynthesis (F1,5=288.0, p<0.001), ABC transporter (F1,5 =42.9, p=0.003), 和 ribo?avin metabolism (F1,5= 4050.0, p<0.001)通路顯著下調(diào)。在連作花生根際中，有關(guān)養(yǎng)分循環(huán)的代謝通路下調(diào)，比如：nitrogen metabolism (F1,5 =784.0, p<0.001), sulfur metabolism (F1,5 =72.0, p=0.001), and oxidative phosphorylation (F1,5 =19.4, p=0.012) (補充圖S2b)。同時，參與氧化應激的代謝通路下調(diào)，如peroxisome(F1,5 =60.5, p=0.001)、半胱氨酸( cysteine )和甲硫氨酸( methionine )(F1,5 =216.0, p<0.001)(補充圖S2b)。 促進植物生長的基因在連作花生根際中表達受限Underrepresentation of genes involved in plant growth promotion in the rhizosphere of monocropped soil通過KEGG數(shù)據(jù)庫鑒定并注釋植物生長相關(guān)的基因(補充表S4)。與輪作相比，連作的氮循環(huán)基因豐度降低，這些基因分別是：nitronate monooxygenase [EC:1.13.12.16], nitrite reductase [EC:1.7.2.1], and nitric oxide reductase EC:1.7.2.4。nifU基因編碼的nitrogen ?xation protein，并在連作花生根際的相對豐度顯著下調(diào)(圖3)。一些編碼非特異性磷酸酶的基因，在連作花生根際中顯著下調(diào),如phosphotransferase [EC:2.7.3.9], phosphoserine phosphatase [EC:2.6.1.52], 3-deoxy-manno-octulosonate-8phosphatase [EC:3.1.3.45], phosphoglycolate phosphatase [EC:4.2.1.12], and inositol-phosphate phosphatase EC:3.1.3.25。這些酶催化有機磷，將其轉(zhuǎn)化為的植物可利用的形式，從而促進植物生長。此外，連作花生根際中參與硫化氫(H2S)和亞硫酸鹽合成的基因下調(diào)(圖3)。參與合成鐵載體的基因也有所下調(diào)，例如：acyl-homoserine-lactone acylase [EC:3.5.1.97] 和 diaminobutyrate-2-oxoglutarate transaminase [EC:2.6.1.76], 4-hydroxybenzoate 3-monooxygenase [EC:1.14.13.2] 以及 chitinase [EC:3.2.1.14] (圖3)。生長素IAA，是由色氨酸通過三種通路合成的，分別是：吲哚丙酮酸( indolepyruvate)、色氨酸(tryptamine)或indole-3-acetamide途徑。一些編碼吲哚-3-乙酰胺和吲哚丙酮酸的基因，在連作花生根際顯著下調(diào)，例如：aldehyde dehydrogenase[EC:1.2.1.5]、nitrilase[EC:3.5.5.1]、tryptophan 2,3-dioxygenase[EC:1.13.11.11]、indolepyruvate ferredoxin oxidoreductaseEC:1.2.7.8。Trp聚類基因和色氨酸合成的基因，也存在下調(diào)現(xiàn)象，如anthranilate synthase [EC:4.1.3.27]和 tryptophan synthase [EC:4.2.1.20]。近期研究表明揮發(fā)性化合物羥基丁酮(acetoin)和2,3-丁二醇通過刺激根的形成直接影響植物的生長。有趣的是,在連作花生根際，參與編碼羥基丁酮的以下基因均下調(diào)，如pyruvate dehydrogenase[EC: 1.2.5.1],alcohol dehydrogenase[EC: 1.1.1.2],diacetyl reductase[EC: 1.1.1.4 1.1.1.-1.1.1.303], S-(hydroxymethyl) glutathione dehydrogenase[EC: 1.1.1.284 1.1.1.1],和hydroxyphenylpyruvate dehydrogenase[EC: 1.13.11.27]。 連作土壤抑制了植物的生長Lower plant performance in the monocropped than in rotation soils與輪作土壤相比，連作土壤抑制了花生植株的生長，但不會使植株發(fā)病，例如株高、根長、地上部重量和根重均比輪作花生低得多(圖4a)。若將花生植株種植在蛭石上，并接種輪作土和連作土的細菌懸液，也會得到類似的結(jié)果(圖4b)。 Comparative transcriptome analyses of peanut roots比較花生根部轉(zhuǎn)錄組熱圖顯示，在連作和輪作土壤中，花生基因的表達方式有著明顯差別(圖5a)。植物激素不僅是植物生長發(fā)育的必要物質(zhì)，并且影響著宿主與微生物的相互作用。因此，我們評估了一些編碼合成植物激素基因的表達情況，這些基因有：合成生長素(auxin)、細胞分裂素(cytokinin)、脫落酸(AA)、水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)等基因(圖5b)。此外，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，在連作花生中，一些合成生長素的基因被發(fā)現(xiàn)下調(diào)，這些基因有auxinresistant1 (AUX1), AUX/IAA, auxin response factor (ARF)和small auxin-up RNA(SAUR)(圖5b)。在細胞分裂素途徑中，A-ARR和B-BRR轉(zhuǎn)錄因子基因顯著下調(diào)，而編碼GID1和參與有關(guān)赤霉素信號傳導的基因顯著上調(diào)。相反，大多數(shù)來自SA、JA和ET信號通路的基因以及編碼AA合成轉(zhuǎn)錄抑制因子的ABF基因均會上調(diào)(圖5b)。此外，在連作花生中，許多植物對細菌的響應基因都會上調(diào)，包括鞭毛蛋白(?agellin)和EF-Tu(補充圖5)。然而，多數(shù)與真菌病原體應答相關(guān)的基因，其表達量并沒有明顯改變。連作花生中，參與谷氨酸合成的部分基因(如GLU2)下調(diào)(補充圖S5)，而許多參與iso?avonoid、phenylpropanoid合成的基因表達均上調(diào)(補充表S5)。
討論在影響植物生長和健康方面，根際微生物群落被廣泛研究，并且大多數(shù)研究關(guān)注有益細菌對植物的影響。然而，我們知道農(nóng)藝活動對根際微生物群落的組裝的影響會導致作物產(chǎn)量受到影響，并且就這方面的研究也是必要的。在本研究中，我們使用宏基因組測序來描述不同耕作制度下，花生根際微生物群落的組成變化以及潛在功能變化。表明，在連作花生的根際，稀有物種比非優(yōu)勢物種和普通物種的含量要高。這說明花生連作增強了某些微生物物種在花生根際的定植能力。為了揭示微生物群落改變 背后的潛在影響因素，我們使用轉(zhuǎn)錄組對花生基因表達特征進行分析。表明，連作花生土壤中聚集的微生物群落可能抑制了花生激素的信號傳導過程。植物特定的根系分泌物可驅(qū)動和塑造根際微生物群落。目前的研究表明，耕作歷史或作物品種會對花生植株根際群落產(chǎn)生一定的影響。許多研究一致表明，農(nóng)藝活動會影響根際微生物群落。輪作時，由于寄主植物與其他作物品種交替種植，這或許會使前一種作物產(chǎn)生選擇效應，造成土壤中某些微生物豐度下降。相反，連作會反復將相同的根系分泌物釋放到土壤中，從而促進某些微生物物種在根際的定植。例如K. racemifer, Burkholderiaspp.和O.terrae，會優(yōu)先利用特定的根系分泌物，并在連作花生根際高度富集。這表明植物會招募有分解根系分泌物能力的菌群。然而，某些細菌相對豐度的增加將涉及資源和空間的競爭問題。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)連作花生根際有著相對豐富的能量代謝通路，如肌醇磷酸代謝、淀粉和蔗糖代謝以及各種糖降解途徑(補充圖S2a)。重要的是，我們也觀察到了細菌趨化和核苷酸切除與修復功能等功能富集，這些功能與植株根際競爭力有關(guān)。 我們利用宏基因組將與植物生長發(fā)育相關(guān)的根際微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能聯(lián)系起來(補充表S4)。與輪作相比，連作根際的特有的基因豐度較低，減少了花生的生物量(圖3)。同時，從近年來對擬南芥和大豆根際功能特性的研究來看，礦物質(zhì)的代謝對植物生長具有重要意義。目前在酸性土壤的研究中，有效的可溶性磷酸鹽和有效氮會抑制植物的生長。我們觀察到花生根際參與氮素代謝的基因會在連作處理中下調(diào)，同時，可溶磷酸鹽和硫的循環(huán)途徑受阻；根際合成植物激素(這些化合物都通過刺激根的分枝和伸長來促進植物生長)的功能顯著減弱，包括IAA、乙酰乙酸和2,3-丁二醇等。我們還觀察到，連作花生植株生長緩慢。不同耕作制度植株招募不同的根際微生物群落，并且有著不同的植物表型。這些結(jié)果共同表明了微生物可能是聯(lián)系耕作制度同植物表型的紐帶?；形镔|(zhì)在土壤中的積累可能對連作體系植株生長有負面影響，但是我們的研究發(fā)現(xiàn)了不同的現(xiàn)象。首先是我們盆栽使用的土壤在連作過后的八個月，那個時候易揮發(fā)的化感物質(zhì)（通過微生物分解，等）在土壤中的含量可能達不到對植物的致毒計量；其次，我們使用土壤懸液做驗證試驗，其中殘留很少的化感物質(zhì)，更可能是微生物在其中起著重要作用。事實上，這一現(xiàn)象支持我們的假設(shè)：植物分泌化感物質(zhì)，并通過化感物質(zhì)招募不同的微生物群落，反饋到植物，導致植物擁有不同的表型特征。因此，更多的工作應該關(guān)注在化感物質(zhì)同微生物群落和植物之間的相互關(guān)系。 然后，我們使用轉(zhuǎn)錄組測序來比較連作和輪作土壤中花生植株的基因表達情況。結(jié)果表明，與植物激素合成的有關(guān)通路參與了植物根際微生物群落與花生植株的相互作用。參與調(diào)控生長素、細胞分裂素、AA、SA、JA和ET合成途徑的基因可能是連作土壤中植物生長受阻的原因。例如：在連作花生土壤中與類黃酮生物合成相關(guān)的基因上調(diào)，這一現(xiàn)象可能與激素合成的相關(guān)基因(如生長素和細胞分裂素)下調(diào)有關(guān)。眾所周知過量的AA、SA、JA和ET等會抑制植物的生長。作為一種豆類，我們觀察到了不同耕作歷史會影響花生根瘤的形成。根據(jù)許多研究報道，植物生長素平衡發(fā)生改變是根瘤形成的先決條件。在本研究中，控制連作花生分泌生長素的基因表達量降低(GH3、AUX1)，這可能會影響花生根瘤的形成(因為這些基因的表達是根瘤形成所必需的)。此外，有幾項研究還報道了SA、ET、JA和AA信號會對根瘤菌感染率和結(jié)瘤率以及結(jié)瘤強度造成的負面影響。因此，植物激素信號的變化可能會導致連作花生土壤中花生根瘤數(shù)量減少；另一方面，激素信號的改變可能降低根瘤菌的定植率，因為結(jié)瘤十分依賴于植物碳水化合物提供的能量?？傊?，我們的結(jié)果為優(yōu)化宿主-根瘤菌共生的機制提供了一些線索。因此，我們需要進一步研究連作對花生根瘤的形成、對根瘤菌共生行為及其遺傳途徑所產(chǎn)生的影響。 此外，植物根系調(diào)控的與微生物相關(guān)的分子過程對根際微生物的定殖起著重要作用，但對病原菌致病性方面的作用不大。眾所周知的例子是細菌鞭毛蛋白和EF-Tu。事實上，在本研究中觀察到連作花生體系下細菌運動相關(guān)的基因上調(diào)，但對真菌對應的相關(guān)的基因沒有應答。這表明，與輪作相比，連作增加了一些細菌的生存壓力。 結(jié)論我們對宿主相關(guān)微生物群落進行宏基因組分析，闡明了根際微生物群落功能的重要性。我們的研究揭示了耕作歷史會對當前作物根際微生物群落產(chǎn)生重要影響，并且根際微生物群的組裝與植物的表型密切相關(guān)。連作后，因控制合成植物激素的基因發(fā)生了調(diào)動，影響了激素的分泌，從而驅(qū)動了同類根際微生物種群在根際的富集，導致土壤的微生物群落功能的下降，致使植物表型發(fā)生變化?？偠灾?，本研究闡述了土地利用歷史對植物表型的影響，為將來通過選擇特定的根際微生物類群以提高植物的性能提供理論依據(jù)。 材料方法田間實驗處理Field trial and treatments實驗田位于在中國江西省中科院(28°130′ N, 116°550′ E)。這塊試驗田于2011年8月開始休耕，隔年6月，我們將該塊試驗田分割為6塊(每塊大小6m×10m；且我們隨機排列了這6塊試驗田)，它包含了2種處理以及3個重復:Ⅰ.種植花生(連作);Ⅱ.第一年種植花生第二年種植其他作物，由此往復(輪作)。在品種選擇上，連作處理的試驗田中，我們持續(xù)種植了4季(2012-2015)花生(Ganhua-5)；在輪作處理的試驗田中，我們在第一年和第三年種植花生，在第二年和第四年分別種植玉米(Zea mays L.)和馬鈴薯(Solanum tuberosum)。每塊試驗田都是在4月播種，并在當年8月完成收獲，隨后休耕到第二年4月才繼續(xù)播種。常用農(nóng)田管理的人工操作包括：耕作、施肥和除草。實驗設(shè)計在(圖1)中進行了總結(jié)，在補充材料方法中有描述了種植細節(jié)。試驗田的土壤為地丘紅壤(FAO 1998 classi?cation)，并在表S1中對其理化性質(zhì)進行了補充。 花生幼苗盆栽實驗Peanut seedling cultivation in a pot experiment在2016年播種前，我們在每塊試驗田(共6塊)上隨機取樣30kg土壤(在土體表面0-20cm處)，并去除植物殘體將其均勻混合(圖1)。每塊試驗田都有5盆土壤(每盆均盛有3kg隨機取樣的土壤樣品)，并且每盆都要接種消過毒的花生種子(Ganhua-5)。因此，6塊試驗田，每塊田有5個生物學重復，共30個實驗小區(qū)(5盆×3種重復×2種處理)。經(jīng)過30天的種植，通過收獲，我們將根際土壤小心的收集起來，并且混合每塊試驗田的根際土壤。因此，連作和輪作處理都會有3個獨立重復的土壤樣品可用于后續(xù)分析(圖1)。 我們從土壤中分離了花生根系，并用蒸餾水沖洗它們。我們將所有感病植株的根系以及花生的根際土樣用液氮速凍，保存于-80℃，用于后續(xù)的下游分析。后面我們用“連作花生”和“連作花生的根際”( “monocropped peanut rhizosphere”),來表示連作處理，用“輪作花生”和“輪作花生根際( “rotation peanut” and “rotation peanut rhizosphere”)來表示輪作處理。 微生物對植物表型影響實驗Determination of plant growth responses to bacteria extracted from the ?eld soils評估植物生長對土壤微生物群落響應的細菌懸液：從每一塊試驗田中均取5g干土與50ml無菌水混合，并放置在200rpm的搖床上，震蕩1h，用47kHz超聲2次，再震蕩0.5h。之后，用5μm的濾膜濾掉懸液中大部分的真菌。所以，我們一共制備了6種細菌懸液(2種處理3個重復)。我們對Li等人的方法進行了輕微的修改，在無菌條件下培育花生幼苗。首先，按照補充材料中的方法對花生種子的表面進行消毒。然后，在裝有無菌蛭石和50ml無菌霍格蘭營養(yǎng)液(1\4濃度)的200ml燒杯中種植一株生長良好、未感病的幼苗。將4個種有植株的200ml燒杯共同放入一個5L的燒杯中，并在5L燒杯上覆蓋四層無菌紗布(防止微生物污染),將其放置在植物生長室中進行培養(yǎng)(溫度為30°C,相對濕度為70%，光照強度為500μMm-2s-1)(圖.4b)。經(jīng)過7天的培育，我們將兩種處理的菌懸液取5ml加到蛭石中；對照組則加入5ml無菌水。每塊試驗田都會用4株花生幼苗(用該塊試驗田菌懸液培育的幼苗)來代表。 花生根系微生物的宏基因組分析Metagenomic DNA analyses of the peanut rhizosphere community為了能夠獲得足夠的DNA(每個樣品2μg)，我們從根際樣品中提取4-6份加入到 FastDNA SPIN 試劑盒中；采用美國Thermo Scientific公司的NanoDrop測定DNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性；同時利用Covaris M220(Thermo Scientific, USA)制備約300bp的DNA文庫，并用Illumina Hiseq 4000儀器(Illumina,USA)進行測序。產(chǎn)生了30Gb的數(shù)據(jù)，平均讀長為151bp(補充圖表S2)。我們在3’端利用FASTX保留了讀長為20bp~50bp的高質(zhì)量的序列(＞97.1%)用于下游分析。宏基因組和蛋白編碼基因的組裝如前所述。利用USERCH(E<1×10-5)將所有目錄里的DNA都翻譯為氨基酸序列，并與KGGE中v59的數(shù)據(jù)庫進行比對，并將KGGE中的同源基因與蛋白質(zhì)序列匹配。我們利用特定的注釋基因豐度之和來預測同源基因的豐度，并利用MG-RAST服務器，以最佳氨基酸序列為模板，估算了微生物分類群基因組的相對豐度。 花生的宏轉(zhuǎn)錄組測序分析Peanut plant metatranscriptome analysis利用Trizol?試劑((Invitrogen, Carlsbad， USA),將RNA從花生幼苗的根部提取出來。用安捷倫2100生物分析儀(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)測得樣品平均的RNA完整指數(shù)(RIN)為8.1(補充圖S1)。利用磁力攪拌的方法將mRNA從總RNA中分離出來，并將其破碎至200bp。將這些mRNA片段作為模板，利用由逆轉(zhuǎn)錄酶啟動的隨機六聚體反應，合成cDNA。采用上標雙鏈cDNA合成試劑盒合成雙鏈cDNA。然后使用QIAquick PCR提取試劑盒(Qiagen，德國)純化cDNA，并在末端修復poly(A)，與測序適配器連接。按說明書講解，在Illumina HiSeq 4000平臺(Illumina, USA)上進行測序。比對SOAPdenovo中的Arachis ipaensis基因組序列，丟棄低質(zhì)量的原始序列，并從每個庫中收集干凈的序列。A.ipaensis基因組數(shù)據(jù)從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載。計算參考基因reads的分布，利用比對數(shù)據(jù)進行覆蓋率分析?；虮磉_水平通過RNA測序(RNA測序-seq)，并使用Cuffdiff按M映射讀取每kb的外顯子模型(RPKM)。利用Cuffdiff算法確定差異表達基因所對應的p值。根據(jù)每個樣本歸一化后的基因表達量，確定表達量的折線變化(如log2比值)。以錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR) >0.001的閾值和log2比值>3的絕對值來判斷各處理間基因表達量的差異。我們?yōu)榱舜_定不同處理中差異明顯的通路，進行了KEGG富集分析(q值<0.05表示基因組明顯富集)。 統(tǒng)計分析利用STAMP軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，來鑒別連作和輪作花生根系微生物群落組成的差異。利用Welch的t檢驗(p<0.05)顯著性檢驗測定根際微生物組成和代謝通路間的聯(lián)系，并用Newcombe–Wilson模型估計置信區(qū)間。我們通過R中的”vegan”包測定Shannon多樣性；利用主坐標分析(PCoA)生成的分類和功能豐度矩陣，對樣品的群落結(jié)構(gòu)進行可視化；使用PAST的軟件生成所有樣本的Bray-Curtis相似度矩陣，做出PCoA圖；采用單因素方差分析方法，研究了土壤類型對微生物組成和功能多樣性產(chǎn)生的影響。我們用KGGE的同源序列進行基因功能分析，采用Wilcoxon的秩檢驗各組間的豐度差異，并對多次測試的p值進行了修正。以KGGE同源通路作為報告特征算法的指標，計算差異顯著的KEGG的報告通路。根據(jù)KEGG同源序列的p值對每個通路進行評估，并根據(jù)變化倍數(shù)去計算每個通路的總p值。我們通過對注釋基因的檢測，確定了調(diào)控某些物質(zhì)合成過程的基因，這些過程往往影響著植物的生長，他們包括即吲哚乙酸(IAA)的合成;磷酸鹽(phosphate)的溶解;鐵素體、乙酰膽堿(acetoin)和2,3-丁二醇(2,3-butanediol)的合成;抑制真菌病原體的產(chǎn)生以及抗氧化應激反應和氮、硫的代謝過程等(補充表4)。在花生轉(zhuǎn)錄組KEGG通路分析中，KOBAS檢測了通路中所有表達有差異的基因，并繪制成熱圖以揭示其共同的表達模式(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do)。 登錄號花生根際群落基因組原始序列數(shù)據(jù)和RNA-Seq reads 分別以SUB4375926和SUB4426379為登錄號存儲在GenBank數(shù)據(jù)庫中。 加主編微信 加入群聊關(guān)于微生信生物 你想要的都在這里 |
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Legacy of land use history determines reprogramming of plant physiology by soil microbiomeThe ISME Journal, [9.5]DOI:10.1038/s41396-018-0300-0
Published online: 27 October 2018
第一作者：Xiaogang Li1,2通訊作者Xingxiang Wang1,5 (email: xxwang@issas.ac.cn
xgli@issas.ac.cn)
合作作者：Alexandre Jousset3 Wietse de Boer2,4 Víctor J. Carrión2 Taolin Zhang1 Eiko E. Kuramae 2
圖2aPCOA分析表明連作和輪作土壤中花生根際細菌群落存在顯著差異(p0.05)。MP:連作土壤花生根際，RP:輪作土壤花生根際。**圖2b**花生根際群落Shannon多樣性比較表明，連坐明顯低于輪作。
**圖2c**與優(yōu)勢屬和普通屬相比，花生根際細菌稀有屬相對豐度最高。倍數(shù)變化定義為(MP-RP)/MP，其中MP為連作土壤中細菌屬的相對豐度，RP為輪作土壤中細菌屬的相對豐度。紅色，倍數(shù)變化2。備注：優(yōu)勢屬:>1%，一般屬:0.1-1%，稀有屬:<0.1%。
圖3 不同處理影響了基因的表達水平，從而影響了植物的生長。倍數(shù)變化定義為(MP-RP)/MP，其中MP為連坐土中的基因表達水平，RP為輪作土中的基因表達水平。綠色代表連坐花生根際基因表達量下調(diào);紅色代表連坐土壤花生根際基因表達量上調(diào)。
圖4a 連作土的花生生長狀況明顯劣于輪作土。圖4b 從連作土壤中提取的菌懸液也會抑制花生的生長。MP表示花生生長在連坐土壤中;RP表示花生生長在輪作土壤中。給出了三次重復的均值和標準差。*表示連作和輪作土壤樣品變量的均值有顯著差異(p<0.05)。
圖5a 熱圖顯示了不同基因在連作和輪作土壤中的表達規(guī)律。顏色條表示log10 (RPKM)值，范圍從綠色(?4.0)到紅色(4.0)。圖上部為基因樹、右測為樣本樹。
圖1 本研究主要實驗的流程圖：a.選區(qū)試驗田的地點。b.兩種處理方法圖解。c.在2016年種植季節(jié)開始時，隨機抽取6個地塊的土壤樣品(0-20cm層)，進行盆栽試驗。每一塊地的土壤被轉(zhuǎn)移到五個種植花生的花盆里。d.在收獲時，從每塊田的5個盆中收集植物和根際土壤樣本。(a-d的詳細說明見“田間實驗處理”)e.分析。
