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基于片段的藥物設(shè)計(jì)研究進(jìn)展

 合肥國肽生物 2021-01-13
    [摘要]基于片段的藥物設(shè)計(jì)(FBDD)方法是一種通過篩選碎片庫得到苗頭片段,然后采用基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)策略對(duì)苗頭片段進(jìn)行優(yōu)化和改造獲得先導(dǎo)化合物的研究。其研究過程分為3個(gè)部分:1)設(shè)計(jì)并構(gòu)建片段庫;2)片段庫的篩選;3)利用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)策略對(duì)苗頭片段進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì),最終得到類藥性的先導(dǎo)化合物或候選化合物。通過結(jié)合已經(jīng)上市的3個(gè)抗腫瘤藥物(vemurafenib、venetoclax和erdafitinib)和目前處于Ⅱ期臨床的KRASG12C抑制劑AMG510的研究為實(shí)例對(duì)FBDD的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述與展望。

    基于片段的藥物設(shè)計(jì)(fragment-baseddrugdesignFBDD)是一種通過篩選碎片庫得到苗頭片段,隨后基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)策略對(duì)片段進(jìn)行優(yōu)化和改造獲得先導(dǎo)化合物的研究方法。FBDD方法是為了克服傳統(tǒng)高通量篩選的缺陷而逐步發(fā)展起來的新技術(shù)。高通量篩選由于盲目性大,命中率低,成本高,對(duì)于部分藥物靶點(diǎn)很難篩選得到理想的化合物。FBDD方法基于藥物靶標(biāo)的活性位點(diǎn)是由多個(gè)子口袋組成,首先篩選得到各個(gè)子口袋的特異性結(jié)合片段,再將與靶蛋白各個(gè)子口袋特異結(jié)合的片段以合適的連接子連接起來,組裝成為高活性的化合物。FBDD方法與傳統(tǒng)的高通量篩選獲得苗頭化合物方法相比,具有特異性高、類藥性高、效率高等優(yōu)勢(shì)。

    FBDD作為發(fā)現(xiàn)苗頭化合物的一種關(guān)鍵技術(shù),逐漸成為藥物研發(fā)的主流方法。其研究過程可以分成3個(gè)步驟:1)片段庫的設(shè)計(jì)構(gòu)建(片段通常符合“3規(guī)則”,即:相對(duì)分子質(zhì)量≤300;氫鍵供體數(shù)目≤3;氫鍵受體數(shù)目≤3;計(jì)算脂水分配系數(shù)cLogP3;旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)目≤3;極性表面積≤60?2);2)片段篩選(使用多種生物物理技術(shù)方法篩選獲得與靶標(biāo)具有結(jié)合能力的苗頭片段);3)片段優(yōu)化(基于靶標(biāo)結(jié)構(gòu)特征,通過迭代優(yōu)化策略將苗頭片段優(yōu)化成為先導(dǎo)化合物)(見圖1)。至今已有數(shù)十個(gè)采用基于片段藥物設(shè)計(jì)方法的藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)研究,其中已有3個(gè)藥物(vemurafenib、venetoclaxerdafitinib)被美國FDA批準(zhǔn)上市。

    1FBDD的研究方法

    1.1片段庫的構(gòu)建

    FBDD的第一個(gè)關(guān)鍵步驟是片段庫的設(shè)計(jì)構(gòu)建。大多數(shù)片段庫中的片段分子符合“3規(guī)則”。此外,片段庫的設(shè)計(jì)還包括評(píng)價(jià)化合物的純度、穩(wěn)定性和溶解性等方面。在片段初步篩選時(shí),片段的濃度一般都大于500μmol·L-1,甚至更高。因此,化合物在水溶液中必須有很好的溶解性。

    在構(gòu)建化合物庫時(shí),還應(yīng)避免包含“不良”化合物?!安涣肌被衔锇ǚ翘禺愋缘慕Y(jié)合片段、活性共價(jià)片段、泛測(cè)定干擾化合物(pan-assayinterferencecompounds,PAINS)、螯合劑及易聚集化合物等。具有這些特征的片段在篩選實(shí)驗(yàn)中,即使對(duì)靶標(biāo)沒有特異性的親和力,依舊被作為是命中片段。通常有如下幾種方法去除“不良”化合物:1)計(jì)算篩選可排除一些明顯的“不良”化合物;2)通過表面等離子共振(surfaceplasmonresonance,SPR)實(shí)驗(yàn)中的中性傳感器表面過濾掉一些“不良”化合物,保證化合物的潔凈度;3)在無靶蛋白結(jié)構(gòu)信息時(shí),可通過觀察配體的核磁共振(nuclearmagneticresonanceNMR)波譜去除自聚集化合物;4ALARMNMRaLaassaytodetectreactivemoleculesbynuclearmagneticresonance)方法鑒定泛測(cè)定干擾化合物等。

    此外,增加片段的復(fù)雜度和3D特征”有助于識(shí)別諸如蛋白-蛋白相互作用等難成藥性靶標(biāo)的特異性抑制劑。在片段庫構(gòu)建時(shí),還需平衡片段庫最大程度的多樣化和包含一些復(fù)雜度相對(duì)較高的衍生物以提供初始的構(gòu)效關(guān)系信息。一方面,大量的片段蘊(yùn)含著盡可能多的結(jié)合可能性,可充分探索靶蛋白的結(jié)合位點(diǎn);另一方面,獲得命中片段初始的構(gòu)效關(guān)系信息,可為后續(xù)研究提供關(guān)鍵的指導(dǎo)信息。此外還有一些專門的片段庫,如天然產(chǎn)物片段庫、氟原子片段庫等直接用于篩選。

    1.2片段篩選

    通常情況下,命中片段與靶蛋白僅形成少量的高質(zhì)量相互作用,其結(jié)合親和力一般在100~10000μmol·L-1的范圍內(nèi)。為了檢測(cè)到篩選片段與蛋白之間較弱的結(jié)合作用,必須使用高靈敏的篩選方法。與典型的高通量生物活性測(cè)試相比,片段篩選時(shí)雖然片段濃度更高,但是由于片段庫中的片段往往具有良好的水溶性,避免了因聚集而產(chǎn)生的假陽性分子。在眾多生物物理篩選方法中,NMR波譜法、表面等離子共振SPR、X射線晶體學(xué)和熱遷移實(shí)驗(yàn)(thermalshiftassay,TSA)屬于片段篩選的常用方法。

    1.2.1NMR光譜法NMR光譜法是片段篩選最常用的一種方法,主要分為蛋白質(zhì)觀察法和配體觀察法。在蛋白質(zhì)觀察法中,片段結(jié)合信息是根據(jù)直接觀察同位素標(biāo)記的靶標(biāo)蛋白化學(xué)位移的變化獲得。配體滴定可提供二者相互作用的解離常數(shù)(Kd),并且共振歸屬可以揭示配體的結(jié)合位點(diǎn)。蛋白質(zhì)觀察NMR方法具有很高的靈敏度,被視為片段篩選的金標(biāo)準(zhǔn)。然而,此方法需要大量同位素標(biāo)記[15N/(或)13C]蛋白,且僅適用于相對(duì)分子質(zhì)量低于50000的蛋白質(zhì)。與此對(duì)應(yīng)的配體觀察法,僅需少量且無需同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì),對(duì)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量大小亦無上限要求,如飽和轉(zhuǎn)移差(saturationtransferdifference,STD)、waterLOGSYwaterligandobservedviagradientspectroscopy)和19FT2實(shí)驗(yàn)法。

    1.2.2表面等離子共振SPR是另一種廣泛使用的片段篩選技術(shù)。SPR通過賴氨酸殘基直接固定或使用生物素標(biāo)記蛋白通過鏈霉親和素-生物素相互作用將目標(biāo)蛋白固定在傳感器芯片上。片段流過芯片表面,與蛋白質(zhì)結(jié)合的片段增加傳感器表面附近的質(zhì)量,改變界面的折射率,SPR儀器檢測(cè)該變化。在SPR實(shí)驗(yàn)之前,需要開發(fā)固定靶標(biāo)的方法并測(cè)試固定化靶標(biāo)蛋白的功能性是否正常。SPR方法僅需要微量的蛋白質(zhì),就可以用于數(shù)十個(gè)甚至數(shù)百個(gè)配體的篩選。SPR是一種定量方法,當(dāng)配體的溶解度高于Kd時(shí),可以從劑量反應(yīng)曲線得出Kd。SPR的定量性質(zhì)使其成為研究苗頭片段類似物并確定其構(gòu)效關(guān)系和結(jié)合動(dòng)力學(xué)的理想方法。此外,SPR生物傳感器和儀器的最新進(jìn)展使該技術(shù)能夠檢測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量低于100的蛋白與小分子的結(jié)合,并大大減少了由于非特異性結(jié)合導(dǎo)致的假陽性分子數(shù)目。

    1.2.3X射線晶體學(xué)X射線晶體學(xué)通常被視為確定結(jié)構(gòu)的方法,但它也可用于片段篩選。在FBDD中使用X射線晶體學(xué)有時(shí)可識(shí)別出多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。晶體篩選的優(yōu)勢(shì)是可以直接獲得苗頭片段與靶蛋白的晶體結(jié)構(gòu),這有助于片段的后續(xù)修飾。該方法可能會(huì)產(chǎn)生結(jié)合力很弱的化合物,以至于用結(jié)晶學(xué)以外的任何方法都無法檢測(cè)到它們的親和力,命中的苗頭片段只有經(jīng)過修飾后,才可被其他技術(shù)方法檢測(cè),這強(qiáng)調(diào)了晶體學(xué)作為篩選方法的靈敏性。晶體學(xué)篩選需要強(qiáng)大的結(jié)晶系統(tǒng),并且要求片段和蛋白具有較好的溶解性,對(duì)于一些溶解性差的膜蛋白則不適用。此外,X射線晶體學(xué)篩選盡管可以有效避免假陽性,但是有時(shí)會(huì)導(dǎo)致假陰性。

    1.2.4熱遷移實(shí)驗(yàn)TSA中小分子化合物結(jié)合靶蛋白,形成熱力學(xué)穩(wěn)定性增加的復(fù)合物。每種靶標(biāo)蛋白都有自身的熱熔曲線,隨著溫度的升高,蛋白會(huì)發(fā)生降解。當(dāng)靶標(biāo)蛋白結(jié)合小分子以后,穩(wěn)定性增加,未降解蛋白的量會(huì)提高。在實(shí)驗(yàn)過程中根據(jù)蛋白熔解溫度(Tm)的變化判斷片段對(duì)蛋白的作用強(qiáng)弱。差示掃描熒光法(differentialscanningfluorimetry,DSF)是TSA方法中的一種,每天可以篩選數(shù)百甚至上千個(gè)化合物。在DSF實(shí)驗(yàn)中,蛋白質(zhì)的熱解折疊可通過添加熒光染料來監(jiān)控,該熒光染料與蛋白質(zhì)變性時(shí)暴露出的疏水斑塊結(jié)合。片段的結(jié)合親和力和蛋白質(zhì)解鏈的熱力學(xué)性質(zhì)共同決定了配體存在下蛋白質(zhì)的解鏈溫度,因此該方法篩選中,假陽性和假陰性很常見。DSF一般作為NMR篩選之前的一次富集篩選。

    1.2.5其他方法片段篩選的方法還包括微量熱泳動(dòng)、弱親和色譜、質(zhì)譜技術(shù)及虛擬篩選等。微量熱泳動(dòng)技術(shù)是一種簡單、快速、精確定量生物分子相互作用的方法。它可以測(cè)量分子在微觀溫度梯度場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng),檢測(cè)蛋白水化層、電荷的改變。對(duì)于弱親和色譜,蛋白質(zhì)以類似于SPR的方式固定,待測(cè)試化合物流過陣列。該方法不是記錄折射率的變化,而是測(cè)量與固定蛋白相互作用引起的化合物保留時(shí)間的差異。天然質(zhì)譜法是片段篩選方法的重要補(bǔ)充。最簡單的形式是片段/靶蛋白混合物通過軟電噴霧電離進(jìn)行離子化,根據(jù)靶蛋白分子離子質(zhì)量的增加判斷結(jié)合的片段,可以在多組分復(fù)雜體系中分析片段,片段/靶蛋白對(duì)的氣相豐度可用作相對(duì)結(jié)合親和力的粗略度量。分子對(duì)接可用于預(yù)測(cè)片段的結(jié)合模式及與蛋白的相互作用。分子對(duì)接應(yīng)用于片段庫的虛擬篩選,不僅需產(chǎn)生片段正確的結(jié)合模式,還必須評(píng)估在溶劑環(huán)境中片段與蛋白結(jié)合時(shí)自由能的變化。分子對(duì)接的構(gòu)象搜索算法和打分函數(shù)需要考慮片段的構(gòu)象熵?fù)p失、去溶劑化效應(yīng)、水相互作用及蛋白的構(gòu)象變化等多種因素。因此大部分情況下,分子對(duì)接并不是片段庫篩選的首選。當(dāng)然隨著對(duì)接方法和打分函數(shù)的改進(jìn)和發(fā)展,分子對(duì)接在片段庫篩選中的應(yīng)用也將越來越多。

    鑒于存在多種被廣泛驗(yàn)證和應(yīng)用的片段篩選方法,合理選擇篩選方法是面臨的首要難題。每種獨(dú)立的方法都有假陽性和假陰性的風(fēng)險(xiǎn),明智的策略是確定最佳組合和篩選順序。一種策略是結(jié)合2種或多種篩選技術(shù),并僅跟進(jìn)公共的命中片段。這種嚴(yán)格的方法降低了公共命中片段假陽性的風(fēng)險(xiǎn),但是增加了假陰性的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)際上,一些文獻(xiàn)表明,用不同方法確定的苗頭片段重疊度非常低。這可能是由于不同方法“篩選模式”和“驗(yàn)證模式”之間的差異導(dǎo)致的。另一種策略是選擇一種已被證明對(duì)特定靶蛋白有效的篩選方法作為主要方法,依賴此篩選方法,直到化合物的親和力達(dá)到其他方法可檢測(cè)到為止。

    1.3片段優(yōu)化

    經(jīng)過驗(yàn)證的命中片段活性一般在毫摩爾級(jí)別,往往與蛋白結(jié)合位點(diǎn)處氨基酸殘基形成氫鍵、疏水相互作用等,且即使片段發(fā)展成為較大的分子,片段與蛋白的結(jié)合模式依然保守。這為片段的后續(xù)優(yōu)化提供了一個(gè)高質(zhì)量的起始結(jié)構(gòu)。通常,X射線晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)為后續(xù)的結(jié)構(gòu)改造提供了良好的基礎(chǔ)。如果沒有可用的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù),則需綜合利用分子對(duì)接和生化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等方法確定片段的結(jié)合位點(diǎn)和作用模式。在獲得活性片段與靶蛋白的結(jié)合信息后,利用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)策略,兼顧化合物的合成可行性和類藥性等對(duì)片段進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。片段優(yōu)化主要有片段連接、片段生長及片段融合3種策略。

    1.3.1片段連接在不同位點(diǎn)(最好是相鄰位點(diǎn))結(jié)合的非重疊片段通??梢赃B接在一起生成新的化學(xué)結(jié)構(gòu),這種稱為片段連接的策略是片段修飾最常用的方法。通過連接片段衍生的化合物應(yīng)具有比單個(gè)片段結(jié)合能之和更低的結(jié)合自由能。片段與靶蛋白以特定構(gòu)象結(jié)合,理想的連接鏈將使連接后的化合物中各片段保持與之前相同的作用模式,且連接鏈與蛋白質(zhì)可以形成額外、有利的相互作用,并增加很少的熵?fù)p失。剛性連接鏈可降低結(jié)合過程中自由度和熵的損失。柔性連接鏈則賦予衍生物更多的可旋轉(zhuǎn)鍵,導(dǎo)致鍵合和溶液相中總體構(gòu)象空間增加,從而降低了對(duì)特定靶標(biāo)的選擇性。例如,將作用于凝血酶S1口袋的對(duì)氯苯基四唑(片段a)與作用于鄰近口袋中的氨基醇(片段b)連接得到先導(dǎo)化合物1IC501.4nmol·L-1(見圖2)。

    1.3.2片段生長片段生長指原子被添加到片段中,增加與蛋白形成的相互作用。片段與蛋白復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)是片段成功生長的關(guān)鍵影響因素。蛋白與現(xiàn)有抑制劑的相互作用對(duì)于片段的生長同樣具有重要的指導(dǎo)意義。從片段生長到先導(dǎo)化合物的過程中,配體效率監(jiān)控是一種方便且客觀的評(píng)估片段增加的相對(duì)分子質(zhì)量是否有效的方法。一般認(rèn)為最終化合物的配體效率小于0.3,分子體積過大會(huì)損害藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。盡管通常優(yōu)選添加疏水性官能團(tuán)以增加活性,但是化合物脂水分配系數(shù)過高也會(huì)導(dǎo)致如溶解度差,易聚集及生物利用度低等結(jié)果。因此,應(yīng)首選考慮在片段的特定位置生長極性官能團(tuán),如氫鍵供體或受體,使其與蛋白質(zhì)形成氫鍵相互作用,然后在后續(xù)的生長步驟中增加疏水性片段。例如,在多肽脯氨酰基順反異構(gòu)酶(peptidyl-prolylcis/transisomerase1,Pin1)抑制劑發(fā)現(xiàn)過程中,在片段c的基礎(chǔ)上增加疏水片段甲基、芐基和氫鍵供受體酰胺片段等得到先導(dǎo)化合物2,活性提高了約90倍(見圖3)。

    1.3.3片段融合片段融合是指利用與蛋白質(zhì)有結(jié)晶結(jié)構(gòu)的其他片段和已知配體的結(jié)構(gòu)信息,將重疊分子的結(jié)構(gòu)部分并入片段中,形成大的雜合分子。不同系列化合物活性變化的趨勢(shì)可用于確定與蛋白結(jié)合的重要的片段和相互作用,這些信息有助于將不同系列中的重要片段雜化形成新的衍生物。例如,發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿結(jié)合蛋白抑制劑時(shí),基于片段dIC50=0.032μmol·L-1)與片段eIC50=20μmol·L-1)分別與靶蛋白形成共結(jié)晶結(jié)構(gòu),將二者疊合后片段進(jìn)行融合得到先導(dǎo)化合物3IC50=0.32μmol·L-1)(見圖4)。

    2FBDD技術(shù)的藥物實(shí)例介紹

    2.1處于臨床研究階段和已上市藥物

    1996年雅培公司報(bào)道了識(shí)別結(jié)合在靶蛋白活性口袋的低相對(duì)分子質(zhì)量的片段技術(shù)——核磁共振構(gòu)效關(guān)系研究法(structure-activityrelationshipsbynuclearmagneticresonance,SARbyNMR)以來,FBDD得到了廣泛的應(yīng)用。同時(shí)基于結(jié)構(gòu)生物學(xué)、核磁共振技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展,FBDD方法大大加快了苗頭化合物的發(fā)現(xiàn)效率,在苗頭化合物優(yōu)化成為先導(dǎo)化合物/候選化合物方面產(chǎn)生了不少成功的應(yīng)用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,目前基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)方法獲得的候選藥物中有3個(gè)藥物(vemurafenibvenetoclaxerdafitinib)已經(jīng)被美國FDA獲批上市,另有約21個(gè)藥物處于臨床研究階段(見表1)。

  

     2.2藥物研究案例分析

    2.2.1VemurafenibBRAF是人類重要的原癌基因之一。BRAFV600E突變主要發(fā)生于黑色素瘤、結(jié)腸癌和甲狀腺癌中。該突變導(dǎo)致下游MEKmitogen-activatedextracellularsignal-regulatedkinase-ERK信號(hào)通路持續(xù)激活,從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。Plexxikon公司研究人員建立了數(shù)量約20000個(gè)、相對(duì)分子質(zhì)量在150~350的片段庫用于選擇性的BRAFV600E抑制劑的研究。在200μmol·L-1濃度下,基于該片段庫針對(duì)多種具有典型性結(jié)構(gòu)的激酶家族成員進(jìn)行篩選。其中238個(gè)化合物在200μmol·L-1濃度下對(duì)Pim-1proviralintegrationsofmoloneyvirus1)、p38CSKCterminalsrc-familykinase3種激酶的抑制率大于30%。隨后對(duì)這238個(gè)化合物和上述3種激酶進(jìn)行共結(jié)晶結(jié)構(gòu)解析。如圖5a所示,片段f3-苯胺基-7-氮雜吲哚)與Pim-1共結(jié)晶結(jié)構(gòu)顯示,7-氮雜吲哚片段可與Pim-1鉸鏈區(qū)形成氫鍵相互作用。但該片段對(duì)Pim-1的結(jié)合力較弱(IC50200μmol·L-1)。進(jìn)一步對(duì)不同激酶的結(jié)構(gòu)分析,在保持與鉸鏈區(qū)具有雙氫鍵結(jié)合的基礎(chǔ)上,針對(duì)片段f2、34、5、6位進(jìn)行取代優(yōu)化,從而提高該類骨架抑制劑的活性與選擇性。其中片段g[3-3-甲氧基芐基)-7-氮雜吲哚]對(duì)FGFR1的抑制IC501.9μmol·L-1。片段gFGFR1的共晶結(jié)構(gòu)顯示,7-氮雜吲哚片段可與FGFR1的鉸鏈區(qū)形成雙氫鍵作用,甲氧基與關(guān)鍵氨基酸形成氫鍵作用,從而限制化合物的結(jié)合構(gòu)象(見圖5b)?;谝陨瞎步Y(jié)晶分析,進(jìn)一步在片段g的氮雜吲哚片段3、45位進(jìn)行優(yōu)化,得到代表化合物PLX47204)。PLX4720優(yōu)先結(jié)合在BRAFV600EBRAFWT的活性構(gòu)象中,對(duì)BRAFV600EBRAFWTIC50分別為0.0130.16μmol·L-1。然后將PLX47205位氯原子用4-氯苯基取代,最終得到PLX4032vemurafenib,5)。Vemurafenib的結(jié)合模式與PLX4720相似,結(jié)合在BRAFV600E活性構(gòu)象口袋(見圖5d)。利用生物活性技術(shù)篩選活性片段,隨后采用基于片段生長的FBDD技術(shù)成功研發(fā)獲得vemurafenib結(jié)合模式見圖5d,從最初的片段篩選到vemurafenib被美國FDA批準(zhǔn)上市僅僅用了6年時(shí)間。2011年,美國FDA批準(zhǔn)vemurafenib用于治療BRAFV600E突變的惡性黑色素瘤。Vemurafenib也是首個(gè)成功的經(jīng)FBDD技術(shù)開發(fā)并被批準(zhǔn)上市的藥物。

  

    2.2.2Venetoclax內(nèi)源性細(xì)胞凋亡主要通過Bcl-2蛋白家族調(diào)控。Bcl-2蛋白家族又可分為2類:抗凋亡蛋白,比如Bcl-2、Mcl-1Bcl-XL;促凋亡蛋白,比如BaxBcl-2associatedXprotein)、BakBcl-2homologousantagonist/killer)和BimBcl-2interactingmediatorofcelldeath)。在腫瘤細(xì)胞中,Bcl-2等抗凋亡蛋白會(huì)過量表達(dá),與促凋亡蛋白Bak或者Bax結(jié)合形成二聚體,使Bax或者Bak無法發(fā)揮促凋亡的功能,從而避免細(xì)胞凋亡的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),與Bcl-2等抗凋亡家族蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域是BH3。因此,設(shè)計(jì)BH3模擬物是目前靶向Bcl-2家族蛋白的主要策略。

    2005年,雅培公司運(yùn)用“SARbyNMR”方法篩選小分子片段庫,識(shí)別與Bcl-XLBH3結(jié)合的疏水性凹槽有相互作用的小分子片段。初步的篩選結(jié)果表明,片段h[4'--4-羧酸二苯基,Kd=300±30)μmol·L-1]和片段i[5,67,8-四氫萘-1-醇,Kd=4300±1600)μmol·L-1]分別結(jié)合到疏水性凹槽的相鄰位點(diǎn)(見圖6a)。片段h的羧基與Arg139相互作用,而4'-氟苯基占據(jù)由Tyr101、Leu108Val126Phe146形成的疏水口袋。片段i則占據(jù)了原本BH3多肽鏈上Ile85結(jié)合的空腔。設(shè)想將2個(gè)片段連接將會(huì)得到活性更高的分子,在考察不同的連接方式和片段后,采用磺酰胺連接鏈得到先導(dǎo)化合物6,其對(duì)Bcl-XL親和性大幅提高[Ki=0.036±0.0016)μmol·L-1](見圖6b)。隨后采用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)策略,增加分子與靶標(biāo)結(jié)合的疏水作用,獲得活性更強(qiáng)的化合物ABT-7377),圖6c顯示化合物ABT-737Bcl-XL的結(jié)合模式。然而由于ABT-737的口服生物利用度較差,進(jìn)一步通過增加分子的柔性和親水基團(tuán)的優(yōu)化策略,獲得候選分子ABT-263navitoclax,8),該分子目前處于Ⅱ期臨床研究。隨后在ABT-263的基礎(chǔ)上,雅培公司進(jìn)一步優(yōu)化旨在提高分子的選擇性,最終獲得候選分子ABT-199venetoclax9),其與Bcl-XL的結(jié)合模式見圖6d2016年,美國FDA批準(zhǔn)ABT-199用于治療慢性淋巴細(xì)胞白血病。

    2.2.3ErdafitinibFGFRs是一類典型的受體酪氨酸激酶,其家族包括FGFR1FGFR2、FGFR3FGFR44種受體。FGFRs基因的融合、重排、易位和擴(kuò)增與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。楊森制藥公司研究人員對(duì)Astex專有數(shù)據(jù)庫開展基于片段的篩選,得到鉸鏈區(qū)結(jié)合片段jk,進(jìn)一步利用片段jkFGFR3的共晶結(jié)構(gòu)展開虛擬篩選,得到苗頭化合物10(見圖7c)?;衔?/span>10是在片段k7位引入2,4-二甲氧基芐胺片段。隨后,又用3,5-二甲氧基苯胺片段替換芐胺片段,伸向守門殘基后面的疏水性口袋,得到化合物11,該化合物對(duì)FGFR3的抑制活性達(dá)0.012μmol·L-1。進(jìn)一步優(yōu)化該類化合物對(duì)FGFR家族成員的抑制活性和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì),用含有堿性氨基的烷基鏈取代化合物11中苯胺上的氫原子,從而使側(cè)鏈末端的堿性氮原子與DFG基序上的Asp641產(chǎn)生作用,最終得到JNJ-42756493erdafitinib12),結(jié)合模式見圖7dErdafitinib對(duì)FGFR1、FGFR2FGFR3FGFR4各亞型的IC50分別為0.0012、0.0025、0.0030.0057μmol·L-1。2019年美國FDA批準(zhǔn)erdafitinib用于接受化療后病情發(fā)展并且腫瘤中存在特定FGFR基因突變的局部晚期或轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌患者的治療。

  

    2.2.4AMG510RAS基因家族目前已知的成員包括KRASNRASHRAS,其中KRAS突變最為常見,大約占85%。KRASG12C突變?cè)诜切〖?xì)胞肺癌中約占13%,在結(jié)直腸癌中約占3%~5%,在其他實(shí)體瘤中約占1%~2%。近年來,針對(duì)KRASG12C抑制劑的開發(fā)是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一,尤其是基于變構(gòu)的switchⅡ的抑制劑研究。為了獲得高質(zhì)量的苗頭化合物,安進(jìn)公司研究人員基于Carmot公司開發(fā)的“Tethering”方法針對(duì)KRASG12C進(jìn)行基于FBDD的藥物設(shè)計(jì)?!?/span>Tethering”方法適合于含有反應(yīng)性氨基酸殘基Cys的靶標(biāo)蛋白,化合物庫中小分子結(jié)構(gòu)中都包含二硫鍵。片段與靶標(biāo)蛋白共孵育后,利用電噴霧質(zhì)譜判斷可以“修飾”靶標(biāo)蛋白的片段(見圖8a)。經(jīng)過“Tethering”方法篩選,成功獲得丙烯酰胺類不可逆結(jié)合的“bait”片段i。隨后基于3300個(gè)片段分子庫建立新化合物庫篩選,結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)確定了結(jié)合較好的苗頭化合物13?;衔?/span>13KRASG12C的晶體結(jié)構(gòu)顯示其結(jié)合在P2口袋,且丙烯酰胺與Cys12形成共價(jià)結(jié)合,酰胺基團(tuán)的羰基與Lys16形成氫鍵。處于中間部位的酰胺連接基團(tuán)與氨基酸Ala59Tyr96形成一對(duì)氫鍵,異唑部分指向處于關(guān)閉構(gòu)象的switchⅡ口袋(見圖8c)。

    為提高化合物的活性,進(jìn)一步采用ChemotypeEvolution的組合篩選方法(多輪分子庫構(gòu)建和篩選)獲得活性更優(yōu)的第2代苗頭化合物14。與化合物13的結(jié)合構(gòu)象比較,化合物14的四氫異喹啉部分可占據(jù)由His95/Tyr96/Gln99組成的隱藏口袋,且switchⅡ處于開放式構(gòu)象(見圖8d)?;衔?/span>14在人胰腺癌細(xì)胞上表現(xiàn)較好的抑制活性(IC50=0.067μmol·L-1)。然而,藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)研究顯示由于清除率相對(duì)較高,導(dǎo)致化合物14的生物利用度較低。隨后,安進(jìn)公司將已報(bào)道GDP-KRASG12C抑制劑ARS-162015)與先導(dǎo)化合物14進(jìn)行結(jié)合構(gòu)象疊合(見圖8e),推測(cè)在ARS-1620喹唑啉母核的1位引入取代苯環(huán)等取代基可占據(jù)由His95/Tyr96/Gln99構(gòu)成的隱藏的口袋,合成得到化合物16。進(jìn)一步基于結(jié)構(gòu)和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的優(yōu)化,最終得到AMG51017)。AMG5102019年進(jìn)入臨床研究,也是首個(gè)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)的KRASG12C抑制劑。AMG510的成功研發(fā)也打破了“KRAS是不可成藥靶點(diǎn)”的說法。

    3結(jié)語與展望

    FBDD的研究過程包括高質(zhì)量片段庫的設(shè)計(jì)構(gòu)建,蛋白-片段相互作用的驗(yàn)證和基于結(jié)構(gòu)藥物設(shè)計(jì)指導(dǎo)下的苗頭片段的優(yōu)化等。通過FBDD方法發(fā)現(xiàn)的片段通常具有較高的配體效率,在獲得片段與靶蛋白的結(jié)構(gòu)信息基礎(chǔ)上,利用配體結(jié)合效率為指導(dǎo)方向,快速優(yōu)化片段。近年來,隨著篩選技術(shù)的不斷進(jìn)步,檢測(cè)片段與靶蛋白之間弱結(jié)合作用的表征變得越來越容易,使得FBDD技術(shù)成為近年來發(fā)展最快的藥物研究新方法之一。

盡管FBDD技術(shù)目前取得了巨大的成功,但是仍存在以下幾個(gè)方面需要改進(jìn):首先是片段庫的質(zhì)量,過去幾十年,FBDD技術(shù)強(qiáng)調(diào)了片段質(zhì)量的重要性,即要確保進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選的片段具有合適的物理化學(xué)特性,例如溶解度和避免干擾讀數(shù)(如聚集等)。現(xiàn)在需要同時(shí)保持片段具有良好的理化性質(zhì)且分子量足夠小以滿足大面積化學(xué)空間的需求。其次,提高用于檢測(cè)片段結(jié)合篩選技術(shù)的靈敏度。FBDD方法需要高靈敏地識(shí)別片段分子與靶蛋白的結(jié)合,需要發(fā)展使用微量蛋白,實(shí)現(xiàn)1000μmol·L-1親和力下可靠地檢測(cè)片段與蛋白的結(jié)合。最后,如何高效地優(yōu)化苗頭片段到先導(dǎo)化合物也是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。在結(jié)構(gòu)生物學(xué)和分子對(duì)接等技術(shù)指導(dǎo)下,充分利用片段連接、生長和融合等方法提高先導(dǎo)化合物優(yōu)化設(shè)計(jì)的成功率??傊?,基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)是一項(xiàng)融合藥物化學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)等多學(xué)科的藥物研究新興技術(shù),在未來新藥研發(fā)方面將發(fā)揮重要的作用。

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