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微生物非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備方法

Sample Preparation of Microorganism for Label-free Quantitative Proteomics

趙娜，汪兵，劉飛，謝波*

生命科學(xué)學(xué)院，遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點實驗室，華中師范大學(xué)，武漢市，湖北

*通訊作者郵箱：xiebo@mail.ccnu.edu.cn

摘要：非標(biāo)記 (Label-free) 定量蛋白質(zhì)組學(xué)是一類基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (LC-MS/MS)對樣本蛋白質(zhì)酶解肽段進行質(zhì)譜定量檢測的技術(shù)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各類生物學(xué)研究中^1-3。該實驗的樣本制備過程較為簡易，無需昂貴的同位素標(biāo)記，有利于在大量樣本中有效檢測和比較不同豐度的蛋白質(zhì)表達差異，且能夠被常規(guī)的生物學(xué)實驗室工作人員熟練掌握。水體中的藻類和細(xì)菌在初級生產(chǎn)、物質(zhì)分解、重要元素生物地球化學(xué)循環(huán)等過程中具有重要作用，它們之間也存在著形式多樣的相互作用，繼而對微生物群落的結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生重要影響⁴。在這些微生物的研究中，可采用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法揭示其在不同生長環(huán)境下的蛋白質(zhì)表達譜，為深入認(rèn)識水體微生物群落的結(jié)構(gòu)與功能提供重要線索。本方案則以模式細(xì)菌和微藻為對象，介紹非標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)樣本的制備方法，為微生物在單獨培養(yǎng)或共培養(yǎng)條件下的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)，微藻，細(xì)菌，種間相互作用

材料與試劑

1.0.22μm、5 μm濾膜 (Millipore，catalog number: SLGV033RB)

2.離心管 (Axygen，1.5 ml, 10 ml, 50 ml)

3.Ziptip C₁₈柱子 (Millipore, catalog number: ZTC18S096)

4.丙酮 (滬試，CAS：67-64-1)

5.甲醇 (滬試，CAS：67-56-1)

6.NH₄HCO₃ (滬試，CAS：1066-33-7)

7.NaCl (滬試，CAS：7647-14-5)

8.KCl (滬試，CAS：7447-40-7)

9.Na₂HPO₄ (滬試，CAS：7558-79-4)

10.CaCl₂·6H₂O (滬試，CAS：10043-52-4)

11.KH₂PO₄ (滬試，CAS：7778-77-0)

12.胰蛋白胨 (OXOID，CAS：91079-40-2)

13.酵母粉 (OXOID，CAS：8013-01-2)

14.Tris (國藥集團化學(xué)試劑有限公司，CAS：77-86-1)

15.二硫蘇糖醇 (DTT, Biosharp，CAS：3483-12-3)

16.碘乙酰胺 (IAM, MACKLIN，CAS：144-48-9)

17.胰蛋白酶 (Promega, catalog number: V5073)

18.乙腈 (滬試，CAS：75-05-8)

19.0.1%甲酸水 (FISHER，CAS：64-18-6)

20.十二烷基—β-麥芽糖苷 (DDM, MACKLIN，CAS：69227-93-6)

21.蛋白酶抑制劑 (Roche, catalog number: 04693159001)

22.超純水

23.PBS緩沖液 (見溶液配方)

24.細(xì)胞裂解液 (見溶液配方)

25.TY培養(yǎng)基 (見溶液配方)

26.TAP培養(yǎng)基 (見溶液配方)

27.胰蛋白酶溶液 (見溶液配方)

儀器設(shè)備

1.臺式超速離心機(THERMO ELECTRON BR4i, catalog number:11175674)

2.超聲破碎儀 (Sonics VCX800, catalog number:97496AR-0917 )

3.酶標(biāo)儀（BioTek Synergy-2, catalog number:266256）

4.電泳儀 (BIO-RAD，catalog number:1703810)

5.37°C搖床 （HDL APPARATUS）

6.離心濃縮系統(tǒng) (LABCONCO, catalog number:7810011)

7.循環(huán)水式多用真空過濾系統(tǒng)(上海比朗，型號：SHB-Ⅲ)

實驗步驟

1.培養(yǎng)實驗

1.1微藻的單獨培養(yǎng)

將萊茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii) 接種于50 ml TAP培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)約72 h，光照條件為120 μEm^-2 s^-1，16:8 h光照與黑暗時間，溫度為25°C。

1.2細(xì)菌的單獨培養(yǎng)

以苜蓿中華根瘤菌 (Sinorhizobium rhizobium) 為例，挑取單菌落至50 ml TY液體培養(yǎng)基，28°C條件下?lián)u床培養(yǎng)36~48h。

1.3微藻與細(xì)菌的共培養(yǎng)

利用血球計數(shù)器，調(diào)整微藻與細(xì)菌的細(xì)胞濃度，以約1:100的細(xì)胞比例接種到50 ml TAP培養(yǎng)基中。細(xì)菌在接種前，應(yīng)用藻類液體培養(yǎng)基洗滌3次，每次離心 (9,000 rcf，5 min)收集菌體。在上述藻類培養(yǎng)條件下進行微藻與細(xì)菌的共培養(yǎng)，3天后收集樣品。

1.4樣品收集

1)混合收集

轉(zhuǎn)移微藻與細(xì)菌的共培養(yǎng)物至50 ml離心管，離心收集細(xì)胞 (9,000 rcf，5 min，4°C)。細(xì)胞沉淀用PBS緩沖液洗滌三次后用于蛋白質(zhì)提取。樣品也可用液氮冷凍后存放于-80°C待用。

2)分別收集微藻與細(xì)菌

如需對共培養(yǎng)微生物分別制樣，可利用不同孔徑的濾膜分別收集微藻和細(xì)菌。該方法僅適用于細(xì)胞大小存在較大差異的微生物。首先轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物至過濾器，經(jīng)5 μm濾膜過濾后，收集膜上的微藻細(xì)胞；上述濾液再經(jīng)0.22 μm濾膜過濾或離心收集細(xì)菌。細(xì)胞分別用PBS緩沖液洗滌三次后，進行蛋白提取。樣品也可用液氮冷凍后存放于-80°C待用。

2.蛋白質(zhì)提取⁵

2.1將收集的細(xì)胞重懸于冰上預(yù)冷的0.5 ml裂解緩沖液。

2.2超聲破碎10 min (135 W輸出功率，5 s on，5 s off)。

2.3細(xì)胞破碎完成后，離心除去細(xì)胞殘渣 (13,000 rcf，10min)。

2.4用牛血清蛋白方法 (BSA) 測定上清蛋白的濃度 (見Bio-sharp說明書，示例見圖1A)。并利用SDS-PAGE電泳方法作質(zhì)量控制，查看蛋白降解情況以及半定量驗證，不同樣本上樣量一致時，條帶顏色差異不大（示例見圖1B）。

圖1. A：蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線. 空心圓為標(biāo)準(zhǔn)樣品，紅色棱形點為實驗樣品。結(jié)果表明實驗樣品濃度均在標(biāo)曲范圍內(nèi)，標(biāo)曲可信。B：SDS-PAGE全蛋白電泳. 泳道1 上樣量為20ug，泳道2，3上樣量均為30ug.可明顯觀察到上樣量相同時，SDS-PAGE 顏色一致，而上樣量較少時，SDS-PAGE顏色較淺。

2.5取100 μg的蛋白溶液，加入-20°C預(yù)冷的丙酮 (樣品:丙酮 = 1:6) 后混勻，于-20°C靜置2 h，離心收集蛋白質(zhì)沉淀 (15,000 rcf，10 min，4°C)。

2.6用同體積甲醇洗一次蛋白質(zhì)沉淀，離心后去除上清。

2.7將樣品懸浮于50 μl NH₄HCO₃溶液?？梢岳盟〕暣偃埽羰侨芙庑暂^差，也可考慮先用8μl 8 M尿素溶液重懸，然后用50 mM NH₄HCO₃溶液稀釋至50 μl。

2.8還原反應(yīng)。加入新鮮的DTT母液至終濃度為10 mM，在37°C條件下處理30~45 min。

2.9樣品烷基化。加入碘乙酰胺至終濃度為15 mM，37°C條件下避光處理30~45 min。

2.10蛋白酶消化。加入2 μg胰蛋白酶至樣品中，加入CaCl₂溶液至1 mM，37°C條件下避光處理過夜。

2.11將上述消化物經(jīng)離心濃縮系統(tǒng)至無明顯液體。

2.12將樣品溶解于50 μl 0.1%甲酸水溶液，渦輪震蕩，離心 (15,000 rcf，5 min，4°C)，防止有不溶物影響除鹽效果。

2.13使用Ziptip C₁₈柱子對樣品除鹽：

1)活化柱子。用10 μl Ziptip吸頭吸取10 μl乙腈，重復(fù)洗5~8次；

2)吸取 0.1%甲酸水10 μl，重復(fù)洗柱子5~8次；

3)緩慢吸取樣品，讓蛋白盡可能多的富集到 C₁₈柱子上；

4)用10 μl 0.1%甲酸水重復(fù)洗柱子5~8次；

5)洗脫肽段。用10 μl洗脫液 (含0.1%甲酸、75%乙腈) 重復(fù)洗5~8次柱子。

2.14濃縮樣品，將上述洗脫物經(jīng)離心濃縮系統(tǒng)至無液體，樣品可放于-80°C保存

2.15上樣時，取15 μl 0.1%甲酸水溶液懸浮樣品，Ziptip載樣量為6 μg，一般上樣體積為1~3 μl。

注意事項

1.所有蛋白提取相關(guān)步驟需在冰上操作。

2.超聲破碎過程，每隔5 min拿出樣品搖動一下，防止機器發(fā)熱致使樣品降解，超聲破碎需在冰水浴條件下操作，機器輸出功率為135 W。

3.丙酮等級為優(yōu)級純，并且丙酮應(yīng)至少在-20°C預(yù)冷處理。

4.甲醇應(yīng)在-20°C預(yù)冷2小時以上。

5.使用IAM時應(yīng)現(xiàn)配使用，并注意避光。

6.除鹽過程速度應(yīng)較為緩慢，保證充分上樣。在洗脫肽段過程中溶液體積可能不滿10 μl，這可能是存在氣泡或者吸頭被堵，該步驟與2.12離心步驟相關(guān)。

溶液配方

1.PBS緩沖液

2.裂解液

3.TY培養(yǎng)基

4.TAP培養(yǎng)基參見https://www./網(wǎng)站

5.0.1 M DTT母液

0.0154 g DTT溶于1 ml超純水，DTT應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配

6.胰蛋白酶溶液

100 μg溶于1 ml 緩沖液 (胰蛋白酶自帶)，每次加20 μl

失敗原因

1.超聲破碎細(xì)胞時，可以重復(fù)破碎一次或者延長破碎時間，使細(xì)胞充分裂解。

2.選擇高質(zhì)量離心管及移液器吸頭，減少塑料制品對樣品的污染。

3.在胰蛋白酶酶解時，需要充分酶解，可適當(dāng)延長酶解時間或者二次加酶。

4.除鹽不充分會對質(zhì)譜分析有影響，除鹽過程應(yīng)緩慢吸排溶液，適當(dāng)多重復(fù)幾次。

致謝

感謝國家自然科學(xué)基金(315700983, 31970109)、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費 (CCNU16A02046, CCNU18ZDPY03) 對本研究的資助，感謝華中師范大學(xué)生命科學(xué)院萬翠紅實驗室在實驗中的幫助。

參考文獻

1.Neilson, K. A., Ali, N. A., Muralidharan, S., Mirzaei, M., Mariani, M., Assadourian, G., Lee, A., van Sluyter, S. C. and Haynes, P. A. (2011). Less label, more free: approaches in label-free quantitative mass spectrometry. Proteomics 11(4): 535-553.      

2.Chignell, J. F., Park, S., Lacerda, C. M. R., De Long, S. K. and Reardon, K. F. (2018). Label-Free Proteomics of a Defined, Binary Co-culture Reveals Diversity of Competitive Responses Between Members of a Model Soil Microbial System. Microb Ecol 75(3): 701-719.

3.Mahong, B., Roytrakul, S., Phaonaklop, N., Wongratana, J. and Yokthongwattana, K. (2012). Proteomic analysis of a model unicellular green alga, Chlamydomonas reinhardtii, during short-term exposure to irradiance stress reveals significant down regulation of several heat-shock proteins. Planta 235(3): 499-511.

4.Seymour, J. R., Amin, S. A., Raina, J. B. and Stocker, R. (2017). Zooming in on the phycosphere: the ecological interface for phytoplankton-bacteria relationships. Nat Microbiol 2: 17065.      

5.Wang, B., Yang, L., Zhang, Y., Chen, S., Gao, X. and Wan, C. (2019). Investigation of the dynamical expression of Nostoc flagelliforme proteome in response to rehydration. J Proteomics 192: 160-168.