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人生小哲理 不貶不褒 如實陳述 方為科普之道 正文
撰文：小編來源：生物抗體圈● ● ● 在過去的十年中，細(xì)胞療法，生物制造和合成生物學(xué)的進(jìn)步推動了全球干細(xì)胞療法行業(yè)的發(fā)展。干細(xì)胞治療為一些疑難雜癥提供了一種新的選擇。干細(xì)胞治療的目的就是替代或者再生體內(nèi)功能失調(diào)或受傷的細(xì)胞、組織或器官。干細(xì)胞可以在向患者給藥之前，在體外改變它們的生物學(xué)特性，從而達(dá)到更加精準(zhǔn)和高效的治療。現(xiàn)今，干細(xì)胞的治療從傳統(tǒng)的輸血到自體干細(xì)胞移植，到最新的同種異體工程細(xì)胞治療。  干細(xì)胞分化（圖源：Wikipedia） 然而制造這些“活的藥物”的復(fù)雜性不容小視。每種產(chǎn)品在其開發(fā)、制造、分裝和上市的每個階段，都面臨著特定的挑戰(zhàn)和其不同的復(fù)雜性。在干細(xì)胞治療領(lǐng)域，細(xì)胞原材料就顯得尤為重要，細(xì)胞的來源、穩(wěn)定的供應(yīng)、細(xì)胞運(yùn)輸、制造、產(chǎn)品開發(fā)、治療方案和治療過程這些都決定了治療方法的成敗。 1 間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用 1991年，美國生物學(xué)家Caplan首次從骨髓基質(zhì)的支持性組織中分離出一些成體干細(xì)胞，這些細(xì)胞具有分化成軟骨、骨和脂肪組織的能力，并可為造血干細(xì)胞發(fā)育成各型血細(xì)胞提供所需信號因子，被命名為間充質(zhì)干細(xì)胞( mesenchymal stem cell，MSCs) 。  富含MSC的人體組織 在此之后，有大量研究報道了MSCs 具有分化多能性，在體外誘導(dǎo)條件天，可分化為外胚層( 如神經(jīng)細(xì)胞) 和內(nèi)胚層( 如肝細(xì)胞) 的多種細(xì)胞。目前，雖然各國均開展了大量的臨床研究，但成功轉(zhuǎn)化為商業(yè)化產(chǎn)品的數(shù)量很少。雖然我國尚未批準(zhǔn)任何MSCs商業(yè)化產(chǎn)品上市，但隨著臨床個體化干細(xì)胞治療經(jīng)驗的不斷積累，國產(chǎn)MSCs的申報數(shù)量預(yù)期會逐漸增加。 2 干細(xì)胞療法的質(zhì)量法規(guī)要求 中國的干細(xì)胞臨床試驗，是從以醫(yī)院為主體的醫(yī)療技術(shù)探索開始的。目前在我國，干細(xì)胞按藥品、技術(shù)管理的“類雙軌制”監(jiān)管。按照醫(yī)療技術(shù)監(jiān)管的，稱為干細(xì)胞臨床研究，由衛(wèi)健委監(jiān)管，目前缺少轉(zhuǎn)化應(yīng)用的路徑；按照藥品監(jiān)管的稱為干細(xì)胞臨床試驗，由國家藥品監(jiān)督管理局監(jiān)管，作為藥品上市銷售。 2017年發(fā)布的《藥品注冊管理辦法（修訂稿）》明確指出細(xì)胞治療類產(chǎn)品可以按藥品進(jìn)行注冊上市，緊接著《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》的頒布，更加明晰了細(xì)胞治療作為藥品申報的標(biāo)準(zhǔn)。 對按藥品開發(fā)的細(xì)胞產(chǎn)品，國際上要求其整個生產(chǎn)過程均需符合現(xiàn)行人體組織細(xì)胞優(yōu)良操作規(guī)范（good tissue practice，GTP） 和藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（ good manufacturing practice，GMP） 的要求，保證質(zhì)量和批次間一致性。 對活細(xì)胞制品來說，建議采用質(zhì)量源于設(shè)計（quality by design，QbD）理念對整個生產(chǎn)過程進(jìn)行質(zhì)量控制：
2018年6月至今，中國已經(jīng)有12款干細(xì)胞新藥IND獲得臨床默示許可，其中間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品有種11種，分別是骨髓、牙髓、胎盤、臍帶、異體 / 自體脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。目前，中國尚未批獲任何形式的干細(xì)胞藥物上市。 3 用于臨床級干細(xì)胞制造的基本工藝 MSCs產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝是從供者體內(nèi)獲得組織細(xì)胞，直至成品細(xì)胞輸入到患者體內(nèi)的一系列操作過程，通常還包括細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇，研發(fā)者對其中的每一步工藝和操作均需開展研究和驗證。 有學(xué)者將細(xì)胞庫建立前的過程歸為上游工藝，包括供者細(xì)胞采集和早期小規(guī)模體外培養(yǎng); 而從細(xì)胞庫復(fù)蘇、大規(guī)模生物培養(yǎng)開始，包括細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增、微載體分離( 如采用生物反應(yīng)器工藝) 、純化、濃縮、配制、細(xì)胞清洗、冷凍保存、批簽發(fā)的生產(chǎn)過程被歸為下游工藝。 影響 MSCs 產(chǎn)品的質(zhì)量因素很多。在體外培養(yǎng)過程中主要包括起始原料組織、細(xì)胞分離擴(kuò)增方法、細(xì)胞接種密度、培養(yǎng)基和培養(yǎng)設(shè)備、培養(yǎng)添加物或生長因子，細(xì)胞數(shù)量和存活率、細(xì)胞群體倍增數(shù)等，應(yīng)明確關(guān)鍵質(zhì)量屬性并進(jìn)行控制。專家組建議將細(xì)胞體外傳代次數(shù)控制在20代以內(nèi)。 穩(wěn)定性數(shù)據(jù)是支持MSCs產(chǎn)品應(yīng)用范圍的重要依據(jù)。按藥品開發(fā)的MSCs產(chǎn)品，穩(wěn)定性研究的參照一般生物制品相關(guān)要求，還應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品自身特點、臨床用藥需求以及保存、包裝和運(yùn)輸情況設(shè)計合理的研究方案，同時需關(guān)注產(chǎn)品運(yùn)輸和使用過程中的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性研究應(yīng)能證明，在擬定的存儲條件下，產(chǎn)品的質(zhì)量不會受到運(yùn)輸、使用或其他外界條件的影響。 穩(wěn)定性考察的項目和檢測指標(biāo)，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品自身的特點和存儲條件合理設(shè)計。如冷凍儲存的樣品或產(chǎn)品一般應(yīng)模擬使用情形( 如細(xì)胞復(fù)蘇過程) 開展必要的凍融研究?？疾祉椖拷ㄗh涵蓋生物學(xué)效力、細(xì)胞純度、細(xì)胞特性、活細(xì)胞數(shù)及比率、功能細(xì)胞數(shù)以及安全性相關(guān)指標(biāo)。  MSC 生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵工藝步驟和過程控制要素 4 干細(xì)胞生產(chǎn)工藝流程的建立和優(yōu)化 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞( induced pluripotent stem cells，iPSCs) ，在性能上接近胚胎干細(xì)胞，下面，我們從iPSC作為干細(xì)胞生產(chǎn)的建立為例來談?wù)動嘘P(guān)干細(xì)胞的制造生產(chǎn)。 然而，為了使iPSC發(fā)揮其治療潛力，有必要開發(fā)符合cGMP的iPSC制造工藝并應(yīng)對與iPSC庫的來源、特征和測試有關(guān)的挑戰(zhàn)。我們采取了循序漸進(jìn)的方法來建立合規(guī)、可復(fù)制的、符合CGMP的iPSC制造流程。在此iPSC制造過程的開發(fā)過程中，我們考慮了許多設(shè)計：
  表3：使用從小到大的方法建立了可靠的、可復(fù)制的、符合CGMP的iPSC制造工藝。這是一個三階段方法：（1）使用基礎(chǔ)技術(shù)建立iPSC生成過程；（2）根據(jù)流程的關(guān)鍵屬性進(jìn)行流程優(yōu)化和開發(fā)；（3）將制造過程轉(zhuǎn)移到CGMP制造工廠。每個階段都考慮了許多過程設(shè)計：起始材料的選擇、基因編輯方法的安全性以及第一階段的可行性、基因編輯的效率、用于iPSC生成和擴(kuò)展的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的敏感性和穩(wěn)定性、建立過程控制、細(xì)胞儲存和復(fù)蘇以及表征鑒定（階段2）和細(xì)胞收獲、生產(chǎn)文件、驗證等等。 第1階段：驗證性實驗 首先，我們重點研究iPSC的起始材料和iPSC生成方法的安全性。我們使用源自臍血來源的CD34+細(xì)胞作為起始材料。需要考慮的因素包括：獲得知情同意下的臍血的質(zhì)量，臍血在臨床應(yīng)用中的使用，建立臍血存儲庫，以及從臍血中相高效快速生成iPSC血液來源的CD34+細(xì)胞（與其他起始細(xì)胞類型相比）。  圖1：人類iPSC生產(chǎn)是在基于小鼠胚胎細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中使用基于附加型的編輯方法；圖中顯示了與其相關(guān)系統(tǒng)上的iPSC制造過程，其中包括處理時間（天）和質(zhì)量控制活動，包括過程中間控制和最終表征。制造過程包括CD34+細(xì)胞的啟動步驟、CD34+細(xì)胞的重新編輯和轉(zhuǎn)染，將這些細(xì)胞在培養(yǎng)系統(tǒng)上、選擇、傳代、擴(kuò)增和iPSCs細(xì)胞的儲存。 使用pEB-C5和pEB-Tg質(zhì)粒的組合（使用基于Lonza Nucleofector 2比色皿的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)）生成iPSC之后，選擇了多個iPSC（最少6個到10個），并在組織培養(yǎng)板上連續(xù)傳代培養(yǎng)。 在這一階段的工藝設(shè)計中，使用游離質(zhì)粒使用多個供體分離的CD34+細(xì)胞，可再現(xiàn)生成高質(zhì)量的iPSC。通過PCR方法評估，在第8-10級通過iPSC時清除了這些蛋白。  第2階段：工藝的開發(fā) 在工藝過程開發(fā)階段，我們主要致力于基于培養(yǎng)系統(tǒng)來生成和擴(kuò)展iPSC，以解決有關(guān)培養(yǎng)系統(tǒng)使用的擔(dān)憂。我們通過結(jié)合增強(qiáng)劑來提高其穩(wěn)定性并解決細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生長的iPSC的問題，從而努力提高工藝過程的效率。 多能干細(xì)胞依賴于錨定并以具有確定邊緣的完整細(xì)胞集落的形式生長。它們易自發(fā)分化，而沒有抑制這種現(xiàn)象的必要細(xì)胞培養(yǎng)要求。最關(guān)鍵的細(xì)胞培養(yǎng)要求是可以附著和生長的適當(dāng)?shù)孜?，支持其增殖并防止自發(fā)分化的豐富培養(yǎng)基，以及在保持高活力和多能性的同時連續(xù)繼代培養(yǎng)細(xì)胞的傳代方法。 下圖是最終cGMP兼容iPSC制造過程的示意圖。與iPSC生成過程而建立的初始過程相比，該過程花費了大約40天的時間，但其目的是保持設(shè)定的工藝過程設(shè)計的實現(xiàn)。在第4天（基于對CD34+細(xì)胞密度和生長的評估）完成CD34 +細(xì)胞的引發(fā)和隨后的核轉(zhuǎn)染，而不是在培養(yǎng)過程中進(jìn)行核轉(zhuǎn)染的4-6天完成。  圖4：符合CGMP的人類iPSC制造過程進(jìn)行了概述，該過程在第2階段結(jié)束時進(jìn)行了優(yōu)化，并具有處理時間（天）和相關(guān)的QC活動。該過程包括CD34+細(xì)胞的啟動步驟，CD34+細(xì)胞的重新編程和核轉(zhuǎn)染，將其鋪在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)上，使用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行iPSC的集落選擇、傳代、擴(kuò)增和保存。質(zhì)量控制活動包括表征初始CD34+細(xì)胞，中間iPSC（基于質(zhì)量和質(zhì)粒清除率）以及基于既定的測試和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行最終表征。 階段3：生產(chǎn)工藝的轉(zhuǎn)移 在建立可重復(fù)的工藝流程的iPSC制造流程后，我們致力于將工藝流程轉(zhuǎn)移到cGMP設(shè)施中。從培訓(xùn)運(yùn)行過渡到工程運(yùn)行，再到CGMP制造運(yùn)行，我們解決了許多制造挑戰(zhàn)，包括組織獲取、生產(chǎn)文檔、供應(yīng)鏈、過程驗證、設(shè)施準(zhǔn)備、員工培訓(xùn)、樣品提交策略、倉儲和存儲。請注意，盡管在第3階段對這些活動進(jìn)行了重新評估和完成，但某些活動（例如，與組織獲取和供應(yīng)鏈有關(guān)）已在較早的階段或與第2階段的工藝流程優(yōu)化活動同時啟動。 在cGMP生產(chǎn)的iPSC的QC分析中，這些細(xì)胞符合多能干細(xì)胞的預(yù)定特征，包括復(fù)蘇后的恢復(fù)，通過流式細(xì)胞儀測試的多能性標(biāo)志物（Oct4，Nanog，Tra1-60，Tra1-81和SSEA4）的表達(dá)， EB的形成，遺傳特性與通過STR分析，正常核型分析以及其他標(biāo)準(zhǔn)安全性測試（例如無菌，支原體，病毒安全性和內(nèi)毒素測試）測試的起始原料的匹配性。 結(jié)果證實，我們的iPSC制造工藝是可靠且可重復(fù)的，并且可以根據(jù)CGMP準(zhǔn)則進(jìn)行操作，從而生成高質(zhì)量的iPSC，用于制造用于細(xì)胞修復(fù)性移植策略的臨床級專用細(xì)胞。 我們已經(jīng)證明，在我們過程的每個階段（包括過程開發(fā)，培訓(xùn)和工程運(yùn)行以及GMP制造運(yùn)行）中生成的iPSC都可以滿足多能干細(xì)胞的特性，這是通過標(biāo)準(zhǔn)和合格的檢測方法進(jìn)行評估的。Lonza的iPSC的cGMP生產(chǎn)工藝已通過藥品主文件（DMF號BBMF-16567）提交給美國食品和藥物管理局，在提交研究性新藥申請時可作為參考使用。 5 面臨的挑戰(zhàn) 目前干細(xì)胞治療雖然在臨床試驗中總體表現(xiàn)出較好的安全性，但是除了前文所述的生產(chǎn)工藝復(fù)雜、質(zhì)量影響因素眾多外，還存在不少制約其商業(yè)化發(fā)展的不利因素。 迄今為止,全球范圍內(nèi)開展了大量的干細(xì)胞臨床試驗，適應(yīng)證種類可稱得上包羅萬象，涉及關(guān)節(jié)炎、糖尿病、帕金森病甚至自閉癥等，但是，還缺乏大規(guī)模、多中心、嚴(yán)格平行對照的臨床試驗數(shù)據(jù)證實其有效性。 眾多臨床試驗普遍缺乏嚴(yán)格的臨床前研究。臨床試驗用細(xì)胞的基因表達(dá)和分化特性往往不十分明確，對治療某適應(yīng)證時應(yīng)選擇何種組織來源的細(xì)胞產(chǎn)品以達(dá)到最佳藥效和安全性的相關(guān)研究也很不充分; 在臨床試驗中這些來源于眾多不同部位成體組織的干細(xì)胞在患者體內(nèi)是否能像治療目的需要的那樣向某種細(xì)胞分化通常難以證實。 總之，干細(xì)胞生物制品的商業(yè)化成藥研發(fā)還處在起步階段，研發(fā)者對按藥品管理的細(xì)胞產(chǎn)品的研發(fā)思路和質(zhì)量控制策略還缺乏深入的研究，監(jiān)管機(jī)構(gòu)對于干細(xì)胞產(chǎn)品的理解和認(rèn)識也在累積的過程中。相信隨著科研水平的進(jìn)步和細(xì)胞治療技術(shù)的不斷成熟，在干細(xì)胞治療領(lǐng)域的臨床表現(xiàn)和應(yīng)用前景將逐步得以明確。 參考文獻(xiàn)： [1]Thomson JA,et al.Embryonic Stem CellLines Derived from Human Blastocysts.Science 282,1998:1145–1147. [2]Takahashi K,et al. Induction ofPluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts By Defined Factors.Cell 131,2007:861–872. [3]Chen G, et al. Chemically DefinedConditions for Human iPSC Derivation and Culture. Nat. Meth. 8, 2011:424–429. [4]Dowey SN, et al. Generation ofIntegration-Free Human Induced Pluripotent Stem Cells from Postnatal BloodMononuclear Cells By Plasmid Vector Expression. Nat. Protoc. 7, 2012:2013–2021. [5]Rao M, Ahrlund-Richter L, Kaufman DS.Concise Review: Cord Blood Banking, Transplantation and Induced PluripotentStem Cell: Success and Opportunities. Stem Cells 30, 2012:55–60. [6]Chou BK, et al. Efficient Human iPS CellDerivation By a Non-Integrating Plasmid from Blood Cells with Unique Epigeneticand Gene Expression Signatures. Cell Res. 21, 2011: 518–529. [7]Baghbaderani et al. CGMP ManufacturedHuman Induced Pluripotent Stem Cells Are Available for Pre-clinical andClinical Applications. Stem Cell Rep. 2015: in press. [8]CBER. Guidance for Industry: HumanCells, Tissues, and Cellular and Tissue-Based Products (HCT/P) — Small EntityCompliance Guide. Code of Federal Regulations Title 21, Part 1271. USFood and Drug Administration: Rockville, MD, August 2007.  — END —  - 科普 情懷 責(zé)任 - |
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