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γ-氨基丁酸（簡(jiǎn)稱GABA）是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，約30%的中樞神經(jīng)突觸部位以GABA為遞質(zhì)，它主要存在于神經(jīng)元的細(xì)胞膜上，分為GABAA、GABAB和GABAC三種亞型。 目前關(guān)于基因編碼的鈣指示劑研究很多，已經(jīng)得到了很多的改進(jìn)。興奮性神經(jīng)遞質(zhì)探針也得到了開(kāi)發(fā)，但是關(guān)于抑制性遞質(zhì)探針一直沒(méi)有特別大的突破（1）。 以往有研究報(bào)道GABAB受體上附著有機(jī)熒光團(tuán)的半合成有機(jī)熒光探針，但其對(duì)GABA（400μM）的低親和力限制了應(yīng)用（2）。因此尋求新的GABA熒光探針將有助于促進(jìn)神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究。 近日，美國(guó)霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所Loren L. Looger教授研究團(tuán)隊(duì)在Nature Methods上發(fā)表A genetically encoded fluorescent sensor for in vivo imaging of GABA的文章基于谷氨酸受體iGluSnFR的原理，開(kāi)發(fā)出可檢測(cè)GABA濃度的熒光探針iGABASnFR（3）。 圖源：qyresearchgroups.com 盡管GABA存在許多潛在的支架蛋白，但是GABAA、GABAB是不合適的，這是因?yàn)榍罢叩腉ABA結(jié)合位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)界面（而不是分子內(nèi)），而后者難以異源表達(dá)。 此外，這些受體的過(guò)表達(dá)可能改變細(xì)胞的生理功能。植物病原體根癌農(nóng)桿菌含有兩種與GABA結(jié)合的蛋白Atu2422和Atu4234。其中Atu2422低親和力，Atu4234高親和力。然而，Atu4243在不同位置插入了cpGFP（綠色熒光蛋白）后都不能在離體細(xì)胞上膜上表達(dá)，這就表明Atu4243不適合作為GABA熒光探針的骨架。 研究人員最后識(shí)別出大腸桿菌中異源表達(dá)蛋白Pf622（Atu4243的同源物），在其基礎(chǔ)上改造成可檢測(cè)GABA濃度的熒光探針iGABASnFR（圖1）。 iGABASnFR離體實(shí)驗(yàn)的可行性：攜帶iGABASnFR的AAV病毒感染新生大鼠（D0）后進(jìn)行海馬離體神經(jīng)元的培養(yǎng)，免疫熒光發(fā)現(xiàn)在感染后第14天顯示出iGABASnFR與細(xì)胞膜高度重合，熒光亮度強(qiáng)，這就表明iGABASnFR具有良好的膜定位性。 為了進(jìn)一步證實(shí)iGABASnFR的實(shí)用性，研究人員進(jìn)行電刺激后CA1錐體神經(jīng)元促進(jìn)釋放GABA后iGABASnFR快速響應(yīng)，熒光強(qiáng)度增加，并具有良好的信噪比。 iGABASnFR在實(shí)驗(yàn)的可行性：局灶性新皮質(zhì)癲癇通常伴有異常的皮層腦電圖（ECoG）活動(dòng)，這主要是GABA參與其中引起的。因此，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)癲癇模型進(jìn)一步檢測(cè)iGABASnFR的可行性。皮質(zhì)內(nèi)注射毛果蕓香堿可誘導(dǎo)局部癲癇。在癲癇發(fā)作期間出現(xiàn)異常高頻放電活動(dòng)時(shí)，GABA釋放增多，此時(shí)熒光信號(hào)也迅速增強(qiáng)。 此外，研究人員又在斑馬魚(yú)模型上進(jìn)一步驗(yàn)證，以往研究表明游泳可以激活小腦浦肯野細(xì)胞釋放GABA，可利用光片成像技術(shù)在斑馬魚(yú)小腦中觀察到GABA瞬變（4）。利用iGABASnFR標(biāo)記技術(shù)在游泳開(kāi)始后200ms熒光的變化達(dá)到峰值（圖2）。該結(jié)果表明iGABASnFR可以實(shí)現(xiàn)可靠地檢測(cè)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中局部GABA傳遞過(guò)程。 總的來(lái)說(shuō)，本文通過(guò)基于興奮性神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針的原理設(shè)計(jì)出抑制性神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針iGABASnFR，可以實(shí)現(xiàn)快速、穩(wěn)定的檢測(cè)到胞外GABA的濃度。但是值得注意的是在異氟醚麻醉期間GABA釋放減少，會(huì)影響到iGABASnFR檢測(cè)效率。 參考資料： 1. Marvin, J. S. et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nat. Methods 15, 936–939 (2018). 2.Masharina, A., Reymond, L., Maurel, D., Umezawa, K. & Johnsson, K. A fluorescent sensor for GABA and synthetic GABAB receptor ligands. J. Am. Chem. Soc. 134, 19026–19034 (2012). 3. A genetically encoded fluorescent sensor for in vivo imaging of GABA，https:///10.1038/s41592-019-0471-2 4. Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M. & Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. J. Neurophysiol. 116, 2067–2080 (2016). 作者信息 作者：王果果（brainnews創(chuàng)作團(tuán)隊(duì)） 校審：Simon（brainnews編輯部） 前 文 閱 讀 1，熱議| 中科院院士：我堅(jiān)決反對(duì)馬斯克這種芯片植入式的腦機(jī)接口研究 2，深度解析| 社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位影響大腦功能網(wǎng)絡(luò)連接和解剖學(xué)變化 |
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