一、研究背景

肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的癌癥，其中非小細(xì)胞型肺癌的研究最為廣泛，而關(guān)于肺腺癌（LUAD）預(yù)后標(biāo)志物的研究仍較少?？煽康念A(yù)后標(biāo)志物對高風(fēng)險病人接受手術(shù)后治療有重要意義。因此，本篇文章聚焦于篩選LUAD的預(yù)后標(biāo)志物。

二、分析流程

三、結(jié)果解讀

1.篩選DEGs

作者在GSE10072，GSE2514，GSE43458，GSE32863和TCGA的5個數(shù)據(jù)集中篩選出430個顯著差異表達(dá)的DEGs ，其中128個基因上調(diào)，302個基因顯著下調(diào)。（圖1）

2.DEGs的功能富集分析

作者用GO分析和KEGG通路富集分析研究了430個DEGs的功能和機制。GO分析表明，DEGs主要富集于生物學(xué)途徑（BP）。KEGG富集分析表明。DEGs主要在13個通路中富集。（圖2）

3.構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)鑒定hub基因

作者在STRING數(shù)據(jù)庫中分析了DEGs的相互作用，并用Cytoscape可視化PPI網(wǎng)絡(luò)。如圖3所示，構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中含154個節(jié)點和529個edges。基于連接度≥24篩選出9個hub基因：CDK1，UBE2C，CCNB1，TOP2A，KIF11，AURKB，CD20，CCNB2，CCNA2。這9個hub基因在LUAD中均表達(dá)上調(diào)，并共同構(gòu)成一個功能模塊。

4.GEPIA數(shù)據(jù)庫：9個hub基因的生存分析

為了研究上述hub基因的預(yù)后價值，作者對GEPIA數(shù)據(jù)庫中478個肺腺癌樣本進行OS分析，發(fā)現(xiàn)9個hub基因的高表達(dá)均與不良OS有關(guān)。

根據(jù)四個數(shù)據(jù)集的平均fold change，作者發(fā)現(xiàn)TOP2A和UBE2C在9個hub基因中變異最豐富，且以往沒有大規(guī)模隊列研究TOP2A和UBE2C的預(yù)后價值。因此，作者聚焦于這2個基因進行研究?；虮磉_(dá)分析表明，GEPIA數(shù)據(jù)庫的33個腫瘤類型中，TOP2A和UBE2C分別在25個和28個腫瘤類型中顯著高表達(dá)（紅色）（圖4AB）。且這2個基因間呈顯著相關(guān)。（圖4C）

圖4.GEPIA數(shù)據(jù)庫33類癌癥中分析UBE2C和TOP2A表達(dá)

5.TCGA驗證集：UBE2C和TOP2A表達(dá)和臨床特征的相關(guān)性

為了研究hub基因表達(dá)和臨床特征的關(guān)系，作者在TCGA數(shù)據(jù)框中研究了hub基因和年齡、性別、人種、吸煙史、N期及病理分期的關(guān)系。結(jié)果表明，LUAD患者中UBE2C和TOP2A表達(dá)均高于正常組織，但與上述臨床特征無顯著相關(guān)。

6.TCGA數(shù)據(jù)庫：UBE2C和TOP2A共表達(dá)生存分析、多變量分析及突變相關(guān)性分析

        然后作者在TCGA數(shù)據(jù)庫中研究了TOP2A和UBE2C的共表達(dá)對預(yù)后的影響，首先根據(jù)兩個基因的相對表達(dá)水平將TCGA患者分為4組：均高表達(dá)組，均低表達(dá)組，以及一高一低表達(dá)的兩組。結(jié)果顯示四組患者的OS具有顯著差異，TOP2A UBE2C均高表達(dá)組OS最低。進一步將TCGA患者分為“共表達(dá)組“和”非共表達(dá)組“，發(fā)現(xiàn)共表達(dá)組OS低于其他組。為了排除其他預(yù)后因子的影響，作者又進一步結(jié)合TNM分期進行多變量分析，證實UBE2C和TOP2A是多變量Cox模型的獨立預(yù)后因子。（圖5）

        此外，作者還分析了UBE2C、TOP2A表達(dá)和關(guān)鍵驅(qū)動基因突變的關(guān)系（圖6）。發(fā)現(xiàn)UBE2C在EGFR-WT患者中顯著高表達(dá)，TOP2A在ALK突變患者中顯著高表達(dá)。而它們在KRAS突變和BRAF突變中表達(dá)無顯著變化。

圖6.TOP2A、UBE2C表達(dá)和EGFR、KRAS、ALK、BRAF狀態(tài)的關(guān)系

7.CPTAC數(shù)據(jù)庫：UBE2C和TOP2A的蛋白分析

為了進一步從蛋白水平證實這兩個基因的表達(dá)，作者抽取了111例LUAD和正常匹配組織的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析。與正常配對樣本相比，UBE2C和TOP2A均在腫瘤組織中顯著高表達(dá)。生存分析與TCGA數(shù)據(jù)集一致，即TOP2A/BUE2C均高表達(dá)組預(yù)后較差。相關(guān)性分析也表明，兩基因在蛋白水平也呈顯著相關(guān)。

8.NCC驗證集：UBE2C和TOP2A表達(dá)和臨床特征的相關(guān)性

作者開始建立獨立的驗證集，從648個臨床LUAD患者中篩選出578個患者組成獨立的NCC驗證集（排除了接受手術(shù)前化療/放療、數(shù)據(jù)不完整和丟失隨訪的患者）。進一步用免疫組化染色比較LUAD和匹配的正常組織中TOP2A和UBE2C的表達(dá)。與GEO和TCGA的結(jié)果一致，TOP2A和UBE2C均高表達(dá)于腫瘤中（圖7）。且TOP2A和UBE2C的表達(dá)與性別、吸煙、腫瘤長度、T期、N期、TNM分期等顯著關(guān)聯(lián)。

9.NCC驗證集：TOP2A和UBE2C表達(dá)的生存分析

作者最后在NCC驗證集中用Cox比例風(fēng)險回歸和KM曲線證實TCGA分析的結(jié)果。單變量和多變量分析中（圖8），TOP2A和UBE2C均與OS顯著關(guān)聯(lián)，表明TOP2A和UBE2C是獨立的預(yù)后因子。