腫瘤細(xì)胞通過表型上的變異來躲避免疫系統(tǒng)的識(shí)別和殺傷，而這些變異不僅能加速腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散，還會(huì)使其對(duì)免疫療法產(chǎn)生耐受。過去對(duì)免疫治療后的癌癥患者基因的研究局限于尋找高頻基因變異。近期使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行功能篩選給研究免疫逃逸的機(jī)制帶來了希望，但是腫瘤細(xì)胞中基因如何通過改變表型來進(jìn)行免疫逃逸還缺乏系統(tǒng)性的研究。
近日，來自加拿大多倫多大學(xué)的Jason Moffat團(tuán)隊(duì)在《自然》（Nature）雜志發(fā)表了題為“Functional genomic landscape of cancer-intrinsic evasion of killing by T cells”的論文（Lawson et al., 2020）。他們通過在小鼠腫瘤細(xì)胞系中進(jìn)行CRISPR篩選，成功鑒定出了182個(gè)介導(dǎo)免疫逃逸的基因，稱作“核心癌癥固有免疫逃逸基因”（Core Cancer Intrinsic Immune Evasion Genes），并發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與免疫逃逸相關(guān)的通路，其中調(diào)控干擾素信號(hào)（IFNγ）通路的基因在介導(dǎo)免疫逃逸的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，自噬通路相關(guān)的基因可以對(duì)IFNγ和TNF產(chǎn)生的細(xì)胞毒性產(chǎn)生抗性。另外研究者還發(fā)現(xiàn)了自噬相關(guān)的基因可以與NF-κβ通路的基因發(fā)生復(fù)雜的交互作用，從而控制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。這項(xiàng)研究不僅系統(tǒng)鑒定了腫瘤細(xì)胞參與免疫逃逸的相關(guān)基因，同時(shí)也揭示了基因間的相互作用對(duì)免疫逃逸的影響。首先，研究團(tuán)隊(duì)通過CRISPR-Cas9技術(shù)在6個(gè)小鼠癌癥細(xì)胞系中構(gòu)建了能夠敲除19,069個(gè)蛋白編碼基因的導(dǎo)向RNA（gRNA）文庫（圖1），初步篩選出了182個(gè)對(duì)細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）殺傷作用有抵抗性或敏感性的“核心癌癥固有免疫逃逸基因”。與癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)中T細(xì)胞抗腫瘤應(yīng)答相關(guān)基因集對(duì)比分析后發(fā)現(xiàn)，這些核心免疫逃逸基因與干擾素γ應(yīng)答（IFNγ response）、白細(xì)胞占比（Leukocyte fraction）、先天性抗PD1耐藥性（Innate anti-PD-1 resistance）之間存在相關(guān)性。圖1. 本研究使用的小鼠細(xì)胞系和CRISPR篩選的研究方案
調(diào)控IFNγ信號(hào)通路的基因在182個(gè)核心免疫逃逸基因中排名靠前，因此團(tuán)隊(duì)在添加了IFNγ的小鼠腎癌（Renca）細(xì)胞中使用CRISPR進(jìn)一步篩選出癌癥細(xì)胞中對(duì)IFNγ處理產(chǎn)生應(yīng)答的基因，結(jié)果顯示敏感基因中自噬相關(guān)的基因和Fitm2基因排名靠前（圖2）。Fitm2與小鼠脂肪組織的儲(chǔ)存至關(guān)重要（Miranda et al., 2014），但其與IFNγ通路的關(guān)系仍然未知。研究者接著構(gòu)建了Fitm2敲除的Renca細(xì)胞系，并使用IFNγ或CTL篩選，發(fā)現(xiàn)了與Fitm2有正向或負(fù)向交互作用的基因。意外的是，自噬基因的敲除對(duì)Fitm2介導(dǎo)的IFNγ敏化作用有抑制（圖3），這說明基因間的交互對(duì)細(xì)胞的免疫逃逸具有重要影響，先敲除Fitm2，再敲除自噬基因，反而會(huì)使癌癥細(xì)胞對(duì)IFNγ產(chǎn)生抗性。圖2. 在添加了干擾素的Renca細(xì)胞中使用CRISPR進(jìn)行全基因組篩選后的基因NormZ分?jǐn)?shù)排名。其中黃色為抗性基因，藍(lán)色為敏感基因
圖3. 選擇敲除Fitm2和自噬基因后經(jīng)過IFNγ和CTL篩選得到的不同結(jié)果
當(dāng)在只添加IFNγ的情況下，敲除自噬基因會(huì)抑制Fitm2對(duì)癌癥細(xì)胞的敏化作用；而添加激活的CTL則不會(huì)（圖3），這說明CTL產(chǎn)生的其它細(xì)胞因子會(huì)對(duì)敲除自噬基因后的癌癥細(xì)胞產(chǎn)生作用。由于核心免疫逃逸基因在TNF與NF-κβ通路中有強(qiáng)烈的富集，研究者推測(cè)自噬基因可能在調(diào)控TNF的抗性中發(fā)揮作用。通過CRISPR篩選經(jīng)過TNF處理的Renca細(xì)胞證實(shí)了他們的猜想，在自噬基因和NF-κβ信號(hào)通路的基因敲除后，癌癥細(xì)胞對(duì)TNF的反應(yīng)變得敏感（圖4）。 圖4. 在添加了TNF的Renca細(xì)胞中使用CRISPR進(jìn)行全基因組篩選后的基因NormZ分?jǐn)?shù)排名。其中黃色為抗性基因，藍(lán)色為敏感基因
為了進(jìn)一步確定哪些基因決定了自噬基因介導(dǎo)的免疫逃逸，研究者在敲除自噬基因Atg12的Renca細(xì)胞系中使用TNF和CTL進(jìn)行CRISPR篩選，結(jié)果顯示Atg12與NF-κβ通路下游的基因發(fā)生負(fù)向交互作用，而與上游的基因通常發(fā)生正向交互作用。這說明自噬作用和NF-κβ通路的基因在共同調(diào)控免疫逃逸過程中存在復(fù)雜的交互關(guān)系。令人意外的是，發(fā)生雙重自噬基因突變的癌癥細(xì)胞對(duì)TNF和CTL產(chǎn)生了強(qiáng)烈的抗性，這個(gè)結(jié)果與單獨(dú)敲除某個(gè)自噬基因后的癌癥細(xì)胞反應(yīng)正好相反（圖5），這一發(fā)現(xiàn)意味著，當(dāng)治療某個(gè)自噬基因突變的患者時(shí)，采用靶向另一種不同自噬基因的療法可能會(huì)適得其反，這對(duì)臨床癌癥治療具有啟發(fā)性的意義。圖5. 自噬基因家族間的交互作用在經(jīng)過TNF或者CTL篩選后導(dǎo)致不同的結(jié)果
為了深入研究自噬基因在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮的功能，作者構(gòu)建了能夠敲除182個(gè)核心免疫逃逸基因的gRNA文庫，并在免疫能力完整和缺失的小鼠體內(nèi)分別進(jìn)行CRISPR篩選（圖6）。作者發(fā)現(xiàn)敲除某個(gè)自噬基因的癌癥細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)后期對(duì)具有免疫能力的小鼠敏感性增加，這一發(fā)現(xiàn)證實(shí)了自噬基因在腫瘤微環(huán)境中可以介導(dǎo)癌癥的免疫逃逸（圖7）。圖6. 在小鼠體內(nèi)進(jìn)行CRISPR篩選的設(shè)計(jì)方案
圖7. 上圖：BALB/c背景的小鼠與NCG背景的小鼠在實(shí)驗(yàn)前期和后期gRNA豐度相對(duì)于實(shí)驗(yàn)起始時(shí)刻改變的平均倍數(shù)的差異分布。下圖：自噬基因的gRNA豐度改變的平均倍數(shù)的差異分布
綜上所述，Jason Moffat團(tuán)隊(duì)的這一系列研究結(jié)果不僅在分子水平為我們揭開了助力癌癥細(xì)胞躲避免疫系統(tǒng)追殺的神秘面紗，鑒定出了182個(gè)核心免疫逃逸基因和相關(guān)的信號(hào)通路，挖掘出自噬基因與免疫抗性間的關(guān)系，更是對(duì)腫瘤臨床研究和免疫治療有著突破性的指導(dǎo)意義。1. Lawson, K.A., Sousa, C.M., Zhang, X., Kim, E., Akthar, R., Caumanns, J.J., Yao, Y., Mikolajewicz, N., Ross, C., Brown, K.R., et al. (2020). Functional genomic landscape of cancer-intrinsic evasion of killing by T cells. Nature 586, 120–126.2. Miranda, D.A., Kim, J.-H., Nguyen, L.N., Cheng, W., Tan, B.C., Goh, V.J., Tan, J.S.Y., Yaligar, J., KN, B.P., Velan, S.S., et al. (2014). Fat Storage-inducing Transmembrane Protein 2 Is Required for Normal Fat Storage in Adipose Tissue. J. Biol. Chem. 289, 9560–9572.10月12日，“披荊斬棘，乘風(fēng)破浪——國產(chǎn)測(cè)序平臺(tái)及應(yīng)用創(chuàng)新論壇暨真邁生物新品發(fā)布會(huì)”將于深圳召開，共同見證真邁生物新品發(fā)布儀式。點(diǎn)擊下方圖片，免費(fèi)報(bào)名參會(huì)
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