1. 研究對象特征

人口統(tǒng)計學(xué)和疾病屬性總結(jié)在表1中。除健康對照組外，其他組中男童的比例略高，但在統(tǒng)計學(xué)上并不顯著。單純FA兒童的年齡平均在4.1歲，F(xiàn)A和哮喘的兒童年齡在5.5歲。哮喘兒童平均7.5歲，對照組平均6.3歲。僅單純FA組和單純哮喘組患兒的年齡有顯著性差異（p<0.05）。觀察到種族分布的差異，可能是由于潛在的招募策略造成的，僅哮喘組的非白人患兒的比例略高。與單純FA的患兒相比，哮喘伴有和不伴有FA的兒童過敏性鼻炎患病率略高。與單純哮喘兒童相比，伴有或不伴有FA的兒童特應(yīng)性皮炎的發(fā)生率顯著增高。大多數(shù)FA患兒血清總IgE濃度可用，而伴有哮喘的患兒血清總IgE濃度明顯高于FA患兒，在對照組較低。在FA患兒中，30%的受試患者有1個過敏的現(xiàn)象，其余的有2個或以上的食物過敏。在有哮喘和物哮喘的FA患兒中，用腎上腺素治療的過敏反應(yīng)相似。

表1 研究人群的特征

2. 整體代謝組學(xué)分析

本研究共檢測到1165種生物化學(xué)物質(zhì)，868種已知性質(zhì)的化合物（命名為生物化學(xué)物質(zhì)）和297中結(jié)構(gòu)特征未知的化合物（未命名的生物化學(xué)物質(zhì)）。除去藥物代謝物和異種代謝物后，共有773種化合物被納入分析中。性腺類固醇代謝物水平與年齡密切相關(guān)。這類類固醇的差異沒有報告，因為它們被認(rèn)為反映了年齡效應(yīng)，而不是研究組的真正病理生理特征。

3. FA兒童，哮喘兒童和對照組的比較

對FA患兒和對照組的兒童進(jìn)行兩兩分析，發(fā)現(xiàn)53中代謝物存在顯著差異（如圖1）。其中最突出的是脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，尤其是鞘脂和神經(jīng)酰胺、溶血磷脂、溶酶體原、二酰甘油和脂肪酸。其他代謝物包括氨基酸賴氨酸、蘇氨酸和纈氨酸代謝，以及生育酚的β/γ亞型。這53種代謝物的水平在有和沒有濕疹的FA兒童之間沒有差異，當(dāng)分析僅限于FA沒有濕疹的兒童時，大多數(shù)仍與FA顯著相關(guān)。與哮喘兒童相比，F(xiàn)A患者在兩兩比較中顯示81種代謝物的變化，包括鞘脂、溶血磷脂、單酰甘油和二酰甘油、脂肪酸（單羥基和酰基膽堿）、氨基酸（酪氨酸、色氨酸和組氨酸），膽汁酸和生育酚（圖2）。有趣的是，這81種代謝物在比較有無哮喘的FA兒童時沒有差異，這表明具有這些重疊過敏表型的兒童獲得的代謝組特征與單純FA的一致，而不是哮喘引起的。與對照組和哮喘兒童相比，F(xiàn)A患兒的9種代謝物異常，包括溶酶體原代謝物1-（1-烯基-棕櫚酰）-GPC、溶血磷脂（1-花生四烯酰-GPC、1-亞油酸基-GPC、1-棕櫚烯醇-GPC、1-棕櫚酰-GPC）、N2-乙酰賴氨酸、β/γ生育酚和鞘磷脂。在FA和單純哮喘的患兒的比較中，唯一檢測到的變化報貨次級膽汁酸和芳香族氨基酸（組氨酸、酪氨酸和色氨酸）代謝的變化。

圖1 FA患兒和對照組的代謝物熱圖分析存在顯著性差異（p<0.005）

對于每種代謝物，根據(jù)頂部所示的比例，每個樣品相對表達(dá)用比色法表示。代謝物分為主要的失調(diào)途徑和其他。

圖2 FA患兒和哮喘組的代謝物熱圖分析存在顯著性差異（p<0.005）

對于每種代謝物，根據(jù)頂部所示的比例，每個樣品相對表達(dá)用比色法表示。代謝物分為主要的失調(diào)途徑和其他。

4. FA兒童與對照組比較

哮喘兒童與對照組進(jìn)行兩兩比較，共鑒定出51中存在顯著性差異的代謝物（p<0.005），影響血漿糖原、磷脂、脂肪酸（單羥基、中鏈和二元酸）、鞘脂和氨基酸（賴氨酸、亮氨酸、纈氨酸和蘇氨酸）代謝的變化。其中包括先前報道的與哮喘表型和發(fā)病機制有關(guān)的代謝物，包括氨基酸（蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和谷氨酸）、初級膽汁酸（?；悄懰幔?、脂肪酸（己酸）和磷脂酰膽堿。

5. FA患兒的一個非常明顯的鞘脂信號

在FA患兒中，一個特別突出的途徑是鞘脂代謝。神經(jīng)酰胺和鞘脂代謝的步驟如圖3所示。這一途徑的關(guān)鍵是神經(jīng)酰胺的合成及其進(jìn)一步代謝為鞘磷脂和結(jié)合性神經(jīng)酰胺。與對照組和哮喘兒童相比，F(xiàn)A患兒的這條代謝通路中的一些代謝產(chǎn)物減少（圖3）。在FA患兒中檢測到的大多數(shù)變化似乎集中在神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)化為鞘磷脂、?；窠?jīng)酰胺和葡糖酰神經(jīng)酰胺，而在FA患者中則減少了（圖3，A和B）。這一途徑的改變也與FA嚴(yán)重程度的特征有關(guān)（圖3，C和D）。

圖3 在FA患兒中，鞘脂的改變是顯著的

兩組比較FA患兒和有無哮喘喘兒童鞘磷脂（A和C）和神經(jīng)酰胺（B和D）代謝物，以及FA患兒有或無腎上腺素治療過敏史。*P<0.05和**P<0.005。

6. FA與循環(huán)iNKT細(xì)胞的改變無關(guān)

iNKT細(xì)胞代表一小部分循環(huán)NKT細(xì)胞，它們攜帶一個能夠識別脂質(zhì)部分的不變的T細(xì)胞受體，包括腸道微生物產(chǎn)生的鞘脂，特別是擬桿菌和脆弱B。外周血iNKT細(xì)胞減少與FA有關(guān)。我們試圖研究與哮喘和對照組相比，F(xiàn)A患兒是否存在iNKT細(xì)胞的變化。測定28例FA患者，28例哮喘患兒，15例FA和哮喘患兒以及15例對照組PBMCs中iNKT細(xì)胞的比例。各組間NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞比例無差異。雖然哮喘兒童的iNKT細(xì)胞比例增加，但FA患兒和對照組之間的iNKT細(xì)胞比例沒有差異（圖4）。

圖4 FA患者的循環(huán)iNKT細(xì)胞沒有變化

A.NK、NKT和iNKT細(xì)胞的門控策略。FSC，前向散射；SSC，側(cè)散射。B.FA兒童、哮喘兒童、FA和哮喘兒童（FAA）和對照受試者中NK、NKT和iNKT細(xì)胞的比例。*P<0.05

7. FA嚴(yán)重程度表型的代謝組學(xué)關(guān)聯(lián)

根據(jù)診斷出的FAs數(shù)量和需要肌肉注射腎上腺素的全身反應(yīng)史，進(jìn)一步對FA患兒進(jìn)行分層。共有41種在不同途徑的代謝物在1種食物過敏的FA兒童（n=21）和2種或更多FA的兒童（n=49）之間存在差異。值得注意的是，對1種以上食物有反應(yīng)的兒童表現(xiàn)出血漿糖原和甘油二酯水平顯著升高，在犬尿氨酸和血清素途徑中的色氨酸代謝物以及?；鈮A脂肪酸的水平較低（圖5）。與有和無過敏史的FA患兒相比，共有19種代謝物存在顯著差異。過敏反應(yīng)陽性史與較高水平的吲哚色氨酸代謝物和二十烷酸，較低的支鏈酰基肉堿脂肪酸和鞘脂有關(guān)（圖5）。有趣的是，F(xiàn)A的嚴(yán)重程度的兩個特征都與色氨酸代謝的改變有關(guān)。色氨酸是一種重要的芳香族氨基酸，在腸道中受微生物群的直接影響，并通過3條主要途徑進(jìn)行代謝（圖5），盡管超過1 種食物過敏的FA兒童表現(xiàn)出犬尿氨酸和血清素途徑的代謝物減少，有過敏反應(yīng)史的兒童表現(xiàn)出獨特的吲哚途徑增加，這反映在代謝物吲哚丙酸水平顯著升高。

圖5 在多發(fā)性FA和有過敏史的兒童中色氨酸代謝失調(diào) 

色氨酸代謝的3條途徑與兩組之間代謝物一起描述，這些代謝物在多發(fā)性FA和過敏史兒童中存在顯著差異。*P<0.05和**P<0.005。

8. 次級膽汁酸代謝

FA與哮喘患兒膽汁酸代謝存在顯著差異（圖2）。次級膽汁酸是通過細(xì)菌代謝作用從初級膽汁酸中提取出來的，它們反過來調(diào)節(jié)腸道微生物群的組成。為了確定觀察到的由FA引起的膽汁酸組成的差異是否是繼發(fā)于細(xì)菌代謝的改變，我們比較了反映肝臟和腸道酶轉(zhuǎn)化步驟的不同膽汁酸種類的比率。膽汁酸代謝示意圖如圖6所示。在哮喘患兒中，無論有無FA，膽固醇水平和原發(fā)性膽汁酸代謝，包括經(jīng)典途徑和替代途徑均未觀察到差異。當(dāng)比較微生物衍生的次級膽汁酸與肝臟產(chǎn)生的一級膽汁酸的比率時，F(xiàn)A兒童表現(xiàn)出替代途徑次級膽汁酸熊去氧膽酸（UDCA/鵝去氧膽酸[CDCA]比值）、糖熊去氧膽酸（GUDCA/CDCA比值），?；侨パ跄懰幔═UDCA/CDCA比率）和豬膽酸（HCA/GLCA比率）產(chǎn)生的增加，糖石膽酸（GLCA/CDCA）的生成減少。當(dāng)測試與膽汁酸與甘氨酸或牛磺酸結(jié)合相關(guān)的酶活性時，F(xiàn)A的存在與經(jīng)典途徑（GDCA/DCA比率）次級膽汁酸中甘氨酸結(jié)合降低和替代途徑（THCA/HCA比率）中牛磺酸結(jié)合增加有關(guān)，表明微生物群對初級膽汁酸的加工發(fā)生了變化。

圖6 A-E，F(xiàn)A患兒與哮喘患兒膽汁酸比率的差異

本研究描述了膽汁酸在肝臟和腸道中代謝的示意圖，隨后對哮喘兒童和FA兒童的膽汁酸比率進(jìn)行兩兩比較。*P < 0 .05 and **P< 0 .005.

9. 通路分析

與對照組相比，F(xiàn)A相關(guān)的大多數(shù)失調(diào)通路包括二氫鞘磷脂、乳糖神經(jīng)酰胺、溶酶體原、氧化磷酸化、鞘磷脂和己糖基神經(jīng)酰胺。當(dāng)與哮喘相比較時，F(xiàn)A相關(guān)的失調(diào)途徑包括肌酸代謝、泛酸和輔酶A代謝、脂肪酸（酰膽堿）和次級膽汁酸代謝。

10. 隨機森林分析

FA與對照樣本的隨機森林分析顯示出中等的準(zhǔn)確性（70%）。將哮喘與對照樣本、FA與哮喘樣本相結(jié)合，總體預(yù)測準(zhǔn)確率分別為79%和87%，明顯優(yōu)于偶然發(fā)生的50%比率。在FA患兒中，隨機森林分類對有和沒有哮喘的樣本沒有預(yù)測力，這表明單獨患有FA的兒童和FA與哮喘重疊的兒童之間有很強的相似性。生化重要性圖顯示了FA患兒和對照組受試者比較中的前30種可區(qū)分的生化代謝物（圖B），表明了膜脂（甘油磷脂酰肌醇和鞘磷脂是最具區(qū)別性的）、維生素（γ-和β-生育酚），以及氨基酸（谷氨酰胺、賴氨酸、脯氨酸）的主要差異。1-花生四烯酰-GPC是血小板活化因子代謝過程中的一種血漿糖原和前體，是FA的最高預(yù)測代謝物。在單獨患有FA的兒童和單純患有哮喘的兒童的比較中（見圖B），最具區(qū)別的代謝物是維生素/輔助因子（γ-和β-生育酚和泛酸鹽）、脂質(zhì)（甘油磷酸肌醇）和氨基酸/肽（亮氨酸和硫酸半胱氨酸）。

在這項研究中，對具有不同特應(yīng)性表型的兒童進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，從而確定了與FA相關(guān)的代謝組學(xué)特征。這一特征在FA和哮喘患兒中占主導(dǎo)地位，可能反應(yīng)了FA中不同于哮喘和其他潛在的特應(yīng)性疾病的獨特致病機制。鑒于這項研究的試點性質(zhì)，觀察到的特征需要在更大和更集中的群體中進(jìn)行探索和驗證，以梳理出其他因素的影響，比如種族、飲食、微生物群、特定FAs的存在和其他等等。

FA代謝組學(xué)的一個特征是脂質(zhì)代謝物中存在明顯的變化，最顯著的是鞘磷脂和神經(jīng)酰胺含量的顯著降低。鞘脂是真核生物中一類重要的脂類，從頭合成的鞘脂是細(xì)胞膜的主要成分，參與多種細(xì)胞功能。鞘脂也來源于飲食，可由腸道類桿菌產(chǎn)生。據(jù)報道，血漿鞘脂的變化與嚴(yán)重的過敏性呼吸反應(yīng)有關(guān)。在最近的一份報告中，與臨床FA患者或?qū)φ战M相比，食物過敏兒童糞便中檢測到更高水平的鞘脂蛋白。iNKT細(xì)胞識別非典型MHCI類分子CD1d呈現(xiàn)的脂質(zhì)配體，包括類桿菌物種衍生的鞘脂。在后一項研究中，糞便鞘脂對食物致敏兒童的體外iNKT細(xì)胞激活增加，而FA兒童則沒有。據(jù)報道，牛奶過敏兒童的iNKT細(xì)胞數(shù)量減少，脫敏后增加，表明了iNKT細(xì)胞在FA患者中的作用。然而，我們沒有發(fā)現(xiàn)FA患兒與對照組有iNKT細(xì)胞的差異，哮喘患兒的iNKT細(xì)胞比率出現(xiàn)了微小而顯著的增加，這與之前的結(jié)果一致。

在FA患者中觀察到的鞘脂變化表明神經(jīng)酰胺的生成減少，并且在神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)化為鞘磷脂過程中額外的遠(yuǎn)端步驟減少，可能是由于鞘磷脂合成酶和鞘磷脂酶作用。鞘脂代謝的這一步已在TH17細(xì)胞分化中被發(fā)現(xiàn)，表明這一途徑在調(diào)節(jié)T（Treg）細(xì)胞/TH17細(xì)胞與FA相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)作用。而且，ORMDL3的蛋白產(chǎn)物（一個與哮喘易感性高度相關(guān)的基因）通過抑制從頭合成鞘脂來調(diào)節(jié)鞘脂代謝。這一結(jié)果表明，鞘脂穩(wěn)態(tài)在肺過敏性炎癥中騎著關(guān)鍵作用，為治療干預(yù)提供候選疾病生物標(biāo)記物和潛在靶點。本文研究結(jié)果同樣表明，F(xiàn)A患者的鞘脂代謝中有一個意想不到的潛在的重要作用，而且鞘脂代謝物作為疾病生物標(biāo)志物的潛在用途。

FA患兒表現(xiàn)為其他種類的脂質(zhì)減少，包括溶血磷脂和脂肪酸，如單酰甘油和二酰甘油。最近觀察到溶血磷脂的水平，特別是在FA小鼠模型中的血漿素水平也有類似的降低。值得注意的是，血小板活化因子代謝物前體1-花生四烯酰-GPC與FA呈強負(fù)相關(guān)性，這與最近的報道一致，即血小板功能改變可能在嚴(yán)重食物誘發(fā)呼吸過敏反應(yīng)患者中起作用。這些觀察結(jié)果強烈表明，脂質(zhì)改變在FA發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，需要進(jìn)一步的研究。某些氨基酸（賴氨酸、纈氨酸、蘇氨酸）和維生素E的代謝失調(diào)也與FA有關(guān)。

微生物組的變化與過敏性疾病有關(guān)，包括FA和哮喘。最近在小鼠和人類受試者的FA發(fā)病機制中發(fā)現(xiàn)了生物失調(diào)的關(guān)鍵作用。微生物群可通過多種機制影響宿主，包括通過分泌代謝物。在作者的研究中，患有FA和哮喘的兒童在腸道內(nèi)通過厭氧菌作用產(chǎn)生的次級膽汁酸的比例有明顯差異。特別的是，觀察到替代膽汁酸熊去氧膽酸及其結(jié)合物的生成增加，以及傳統(tǒng)途徑和替代途徑中?；撬?甘氨酸結(jié)合率也有顯著差異。作者的發(fā)現(xiàn)不僅支持FA和哮喘患兒的生物失調(diào)作用，而且表明微生物誘導(dǎo)的代謝產(chǎn)物的差異特征可以在不同的過敏表型中檢測出來，并且可以作為疾病的標(biāo)志。此外，次級膽汁酸激活腸道和其他組織中表達(dá)的膽汁酸受體，以調(diào)節(jié)局部和全身反應(yīng)，包括炎癥和先天性免疫反應(yīng)。膽汁酸的變化與炎癥性疾病的發(fā)病機制有關(guān)，次級膽汁酸代謝失調(diào)的長期影響可能存在于FA患兒中。當(dāng)比較FA和哮喘兒童時，我們觀察到兩種情況下的兒童代謝組學(xué)特征與單獨患有FA的兒童重疊。這項觀察表明，F(xiàn)A的存在提供了一種反映FA致病機制的代謝組學(xué)特征，F(xiàn)A在哮喘的共同存在中占主導(dǎo)地位。與不同的疾病機制相一致的是，有報道稱FA是哮喘惡化的獨立危險因素，包括癥狀的頻率和嚴(yán)重程度。這些結(jié)果表明，在不同的過敏性疾病中，可能影響疾病表現(xiàn)的機制之間存在協(xié)同作用。

FA患者可表現(xiàn)出嚴(yán)重的表型，表現(xiàn)為多發(fā)FAs、危及生命的全身反應(yīng)，或兩者兼而有之。有過敏史的兒童中觀察到鞘脂代謝物的變化（圖3）。鞘脂對肥大細(xì)胞有重要的調(diào)節(jié)作用，鞘氨醇-1磷酸酯作為陽性調(diào)節(jié)因子，由高親和力IgE受體與鞘磷脂和神經(jīng)酰胺代謝物通過抗原特異性交聯(lián)后分泌。在FA患兒中觀察到的鞘脂和神經(jīng)酰胺水平的顯著降低可能反應(yīng)了肥大細(xì)胞對易發(fā)生嚴(yán)重過敏反應(yīng)的高反應(yīng)狀態(tài)。多FAs和過敏反應(yīng)的陽性病史與特定的代謝改變有關(guān)，包括促進(jìn)口服耐受的代謝改變，最顯著的是必需的芳香族氨基酸色氨酸和短鏈脂肪酸。色氨酸通過3種不同的途徑代謝：（1）通過腸道微生物群直接轉(zhuǎn)化為吲哚代謝物，從而激活芳基烴受體；（2）通過2,3-雙加氧酶-1的作用在免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞中形成犬尿氨酸途徑；（3）通過Trp羥化酶-1在腸嗜鉻細(xì)胞中產(chǎn)生5-羥色胺。發(fā)現(xiàn)多發(fā)性FAs患兒的犬尿酸和5-羥色胺途徑中的代謝物水平降低，有過敏史的兒童芳香烴受體配體吲哚丙酸顯著增加。犬尿氨酸和吲哚途徑在黏膜屏障（包括Treg細(xì)胞）的免疫反應(yīng)中都很重要，并有助于腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)。同樣，短鏈脂肪酸影響Treg細(xì)胞歸巢和屏障界面的穩(wěn)定性。因此，作者的發(fā)現(xiàn)表明FA患兒，耐受性代謝途徑的一場可能是疾病嚴(yán)重程度的決定因素。

作者研究的一個關(guān)鍵優(yōu)勢是招募患有1種或重疊性特應(yīng)性疾病（FA、哮喘、FA和哮喘）的患者。醫(yī)生根據(jù)最近出現(xiàn)的IgE介導(dǎo)癥狀和基于IgE的陽性檢測結(jié)果對食品進(jìn)行了FA診斷。這種方法消除了與FA癥狀自我報告相關(guān)的已知偏差，這些偏差已被證明與醫(yī)生對FA的診斷沒有充分的相關(guān)性。另一個優(yōu)勢是疾病嚴(yán)重程度信息的可用性，這使得FA的嚴(yán)重程度和特定代謝途徑的變化之間首次有了關(guān)聯(lián)。同時也存在一定的局限性，這是由于它的試點性質(zhì)。樣本量相對有限。通過應(yīng)用最大顯著性水平（P<0.005）來報告研究組之間的差異來解決這一限制。未來需要更大樣本量的研究來驗證作者的發(fā)現(xiàn)，以及進(jìn)行亞組分析。

患有FA的兒童飲食受到限制，這可能反過來影響他們的代謝組學(xué)特征。為了解決這一問題，研究人員將患有不同脂肪酸的兒童納入研究范圍，以抵消個別食物回避的影響。盡管飲食習(xí)慣可能仍然會影響FA患兒的代謝變化，在研究中檢測到的許多變化涉及到與飲食攝入沒有直接關(guān)系的代謝物，需要確定飲食限制對FA患兒代謝組的影響程度。

總之，本文研究建立了與FA和疾病嚴(yán)重程度相關(guān)的獨特代謝組學(xué)特征。他們還揭示了有哮喘和無哮喘的FA兒童的代謝組學(xué)特征的一致性，這表明FA患者無論是否存在哮喘，都存在不同的疾病機制，與哮喘無關(guān)。觀察結(jié)果表明，代謝組學(xué)分析可以作為一個強有力的方法來提高對FA發(fā)病機制的認(rèn)識，并且是識別候選生物標(biāo)志物和治療干預(yù)靶點的有用工具。