3D多細胞腫瘤球是在體外應用組織培養(yǎng)方法使腫瘤細胞以多細胞集聚體的形式生長成為具有三維結構的球體。

與傳統(tǒng)的2D貼壁細胞培養(yǎng)模型相比，3D多細胞腫瘤球可以通過模擬三維細胞網(wǎng)絡、細胞與基質(zhì)、細胞與細胞之間的相互作用，從而更加貼近腫瘤組織中相應的病理生理特征。

因此，3D多細胞腫瘤球培養(yǎng)模型已經(jīng)逐漸應用于干細胞培養(yǎng)和分化、癌癥研究、藥物和毒性篩選及組織工程等特定應用中。

雖然3D多細胞腫瘤球模型具有更顯著的實體腫瘤生理相關性，但是與2D貼壁細胞培養(yǎng)模型相比，獲得大量相對統(tǒng)一的3D多細胞腫瘤球模型需要一系列的培養(yǎng)過程和表征手段。

本文利用Liquid Overlay的制備方法，以乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7為模型制備3D多細胞腫瘤球并采用倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡和環(huán)境掃描電鏡對其進行詳細表征。

1.提前24 h取12 mL DMEM和RPMI 1640完全培養(yǎng)基（含10%FBS，下同）于50 mL離心管內(nèi)，置于4℃冰箱中預冷；

2. 將分裝好的Matrigel基質(zhì)膠提前24 h從-20℃放入4℃，使其融化成液體狀態(tài)；

3. 將無菌的1 mL移液器槍頭放入無菌50 mL離心管內(nèi)，置-20℃冰箱預冷。

1. 準確量取6 mL RPMI 1640培養(yǎng)基（或DMEM培養(yǎng)基）于2個10 mL的注射玻璃瓶內(nèi)，加入90 mg瓊脂糖，蓋塞后放入80℃的水浴鍋內(nèi)加熱溶解30 min；

2. 加熱結束后，將注射瓶放入滅菌鍋內(nèi)，115℃滅菌30 min；

3. 滅菌完成后，迅速取出注射瓶放入超凈臺內(nèi)。將注射瓶內(nèi)的瓊脂糖溶液倒入無菌的加樣槽中，用多通道移液器以每孔60 μL的量加入96孔板內(nèi)。

注意：由于瓊脂糖溶液在室溫時會凝固，因此從滅菌鍋內(nèi)取出瓊脂糖溶液后一定要快速轉移至超凈臺內(nèi)并迅速加入至96孔板中。

此外，為保證加樣時瓊脂糖不冷卻，需要同時滅菌加樣槽和100 μL的移液器槍頭。

4. 加入完成后，96孔板要保持水平約30 min使孔內(nèi)的瓊脂糖凝固。

1. 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞（或MCF-7細胞），胰蛋白酶消化后進行細胞計數(shù)，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基（或DMEM完全培養(yǎng)基）將細胞懸液濃度調(diào)整至2.0×10⁵  cells/mL，備用。

2. 將盛滿碎冰的燒杯噴完酒精后放入超凈臺內(nèi)，將RPMI 1640完全培養(yǎng)基以及解凍的Matrigel基質(zhì)膠從冰箱內(nèi)取出置于冰上。

注意：由于Matrigel基質(zhì)膠在室溫下溶液凝固，因此在操作過程中一定要保持低溫。

3. 將預冷的移液器槍頭取出放置于超凈臺內(nèi)。根據(jù)計算量（2.5%，v/v）用移液器將300 μL Matrigel基質(zhì)膠加入到12 mL RPMI 1640完全培養(yǎng)基內(nèi)，迅速混勻。

注意：由于Matrigel基質(zhì)膠在室溫下溶液凝固，因此使用的移液器槍頭也需要預冷。

4. 加入步驟1中的細胞懸液（約600 μL），使細胞濃度為10000 cells/mL，迅速混勻，備用；

1. 將上述步驟4中配置好的含有Matrigel基質(zhì)膠的細胞懸液放入加樣槽內(nèi)，用多通道移液器吸取200 μL加入到包被瓊脂糖的96孔板內(nèi)。

2. 采用低溫離心機進行離心，離心條件為4℃，1000×g，10 min。

注意：離心96孔板時為保持無菌，將96孔板的周圍用封口膜封住。

3.離心完成后，取出96孔板，摘下封口膜，噴灑酒精后放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。整個培養(yǎng)流程如圖1所示。

4. 在培養(yǎng)的第3、5和7天，更換孔內(nèi)的100 μL培養(yǎng)基并采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球的形態(tài)。

5.若要采用3D多細胞腫瘤球進行藥物試驗，在培養(yǎng)7天后，用移液器取出孔內(nèi)的100 μL培養(yǎng)基，加入100 μL給藥溶液，然后置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并定期采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球的生長狀況（圖2）。

1. 倒置顯微鏡觀察3D多細胞腫瘤球形態(tài)：直接將96孔板置于倒置顯微鏡下觀察即可。

2. 激光共聚焦顯微鏡觀察：用移液器小心取出孔內(nèi)的腫瘤球，用PBS清洗3遍后，采用4%多聚甲醛固定，并用Hoechst 33258對細胞核進行染色，PBS清洗3遍后在激光共聚焦顯微鏡下觀察（圖3）。

3.環(huán)境掃描電鏡觀察：用移液器小心取出孔內(nèi)的腫瘤球，用PBS清洗3遍后，固定干燥后進行環(huán)境掃描電鏡觀察（圖4）。

圖4