多肽類藥物作為大分子藥物和小分子藥物之間的過(guò)渡態(tài)，也一直是制藥領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。

多肽/蛋白質(zhì)都是由氨基酸這個(gè)基礎(chǔ)單元通過(guò)肽鍵（酰胺鍵-CO-NH-）及其他鍵鍵合而成的。目前，對(duì)于多肽并沒(méi)有一個(gè)十分嚴(yán)格的劃分規(guī)定，通常認(rèn)為20個(gè)以下氨基酸組成的為短肽，也有認(rèn)為5/10個(gè)氨基酸以下組成的為短肽；由20~50/60個(gè)氨基酸組成的肽為中等肽。而我們一般認(rèn)為的肽類藥物為2~60個(gè)氨基酸組成，更大的結(jié)構(gòu)或者是更大的分子量（>5000）則會(huì)被歸入大分子/蛋白類藥物中。

氨基酸作為組成多肽/蛋白質(zhì)的初級(jí)單元，每個(gè)氨基酸均由一個(gè)羧基（-COOH），一個(gè)氨基（-NH2）和一條側(cè)鏈組成。而不同氨基酸之間的差異在于側(cè)鏈的不同。

天然氨基酸都是α氨基酸，對(duì)于氨基酸特有的結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)，其包含一個(gè)酸性基團(tuán)-COOH，和一個(gè)堿性基團(tuán)-NH2。其pKa如下圖所示：

除去上述氨基酸特有的基團(tuán)外，對(duì)常見(jiàn)的氨基酸根據(jù)側(cè)鏈的不同性質(zhì)進(jìn)行分類（酸性、堿性、中性；脂肪族、芳香族等），如下圖所示：

1、酸性

對(duì)于酸性的氨基酸，上圖中所標(biāo)pKa為紅圈圈出位置，用紅色圈表示酸。

2、堿性

對(duì)于堿性的氨基酸，上圖中所標(biāo)pKa為藍(lán)圈圈出位置，用藍(lán)色圈表示堿。

3、芳香族

對(duì)于苯丙氨酸和色氨酸來(lái)說(shuō)，除氨基酸本身代入的α氨基酸結(jié)構(gòu)，側(cè)鏈可能帶進(jìn)酸性基團(tuán)或者堿性基團(tuán)。如上圖中三個(gè)芳香族類的氨基酸中，酪氨酸的側(cè)鏈就帶進(jìn)一個(gè)酚羥基的弱酸。

4、脂肪族

  5、亞胺（成環(huán)）

  6、脂肪醇類

  7、含硫氨基酸

含硫氨基酸具有還原性，其較易氧化。另一個(gè)需要關(guān)注的地方是，當(dāng)多肽鏈中因存在半胱氨酸、蛋氨酸而存在二硫鍵二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，需要特別關(guān)注穩(wěn)定性過(guò)程中二硫鍵交換的產(chǎn)物。

8、酰胺類

末端的酰胺作為一個(gè)非常弱的酸/堿，在一般的分析條件下，可處理為中性，在分析過(guò)程中不用過(guò)多的考慮。當(dāng)然這里的不用過(guò)多考慮僅僅指分析方法design的時(shí)候。在多肽藥物的穩(wěn)定性過(guò)程當(dāng)中，如果肽鏈中存在此類氨基酸，需要特別關(guān)注水解的雜質(zhì)。

我們了解了形成多肽/蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)單元——氨基酸。多個(gè)不同或者相同的氨基酸通過(guò)酰胺鍵（肽鍵）結(jié)合，形成氨基酸序列，即一級(jí)結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié)構(gòu)通常以無(wú)規(guī)則卷曲的方式存在，如下圖所示：

  在某些氨基酸序列中，某些氨基酸通過(guò)分子內(nèi)相互作用，形成α-單螺旋或β-折疊結(jié)構(gòu)，以使得該結(jié)構(gòu)能量最低而使其結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定。α-單螺旋是其一級(jí)結(jié)構(gòu)中位于四個(gè)氨基酸間隙的殘基相互作用形成氫鍵，從而穩(wěn)定整個(gè)分子的結(jié)構(gòu)；β-折疊結(jié)構(gòu)是通過(guò)一級(jí)結(jié)構(gòu)中相鄰的線性段之間形成氫鍵來(lái)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。為使結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定而形成的分子內(nèi)折疊稱為二級(jí)結(jié)構(gòu)，如下圖所示：

在某些氨基酸序列中，某些氨基酸通過(guò)分子內(nèi)相互作用，形成α-單螺旋或β-折疊結(jié)構(gòu)，以使得該結(jié)構(gòu)能量最低而使其結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定。α-單螺旋是其一級(jí)結(jié)構(gòu)中位于四個(gè)氨基酸間隙的殘基相互作用形成氫鍵，從而穩(wěn)定整個(gè)分子的結(jié)構(gòu)；β-折疊結(jié)構(gòu)是通過(guò)一級(jí)結(jié)構(gòu)中相鄰的線性段之間形成氫鍵來(lái)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。為使結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定而形成的分子內(nèi)折疊稱為二級(jí)結(jié)構(gòu)，如下圖所示：

在反相色譜分析過(guò)程中，蛋白質(zhì)由于發(fā)生變性而失去二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象非常常見(jiàn)；但在離子交換或者體積排阻色譜中，卻很少發(fā)生蛋白質(zhì)變性。

多肽/蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)就簡(jiǎn)單介紹到這，了解其結(jié)構(gòu)能幫助我們更好的去進(jìn)行分離分析。

從上一文中我們知道，作為基礎(chǔ)單元的氨基酸除了具有相同的氨基和羧基結(jié)構(gòu)，還具有不同的性質(zhì)，包括酸性、堿性、芳香環(huán)帶進(jìn)來(lái)的大π鍵，巰基等帶來(lái)的還原性。這些氨基酸帶進(jìn)來(lái)的不同性質(zhì)決定了其組成的肽/蛋白質(zhì)的性質(zhì)。由于組成的肽鏈/蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)量通常都較多，故一個(gè)肽可能同時(shí)具有多種不同的性質(zhì)。

相較于小分子，肽類因組成的氨基酸數(shù)量較多，通常具有更大的分子量，更大的分子量帶來(lái)更大的空間結(jié)構(gòu)。

我們來(lái)看3個(gè)不同的肽類的空間結(jié)構(gòu)：

1、依來(lái)多辛（Eledosin）

  作為11個(gè)AA（氨基酸）組成的短肽類，其具有相對(duì)于一般小分子稍大的結(jié)構(gòu)，如下圖所示：

  注：上圖測(cè)試出的分子中最遠(yuǎn)距離原子間的距離為36.11?。

2、鮭降鈣素（Salmon calcitonin）

  注：上圖測(cè)試出的分子中最遠(yuǎn)距離原子間的距離為30~40?。

3、Tesamorelin（替莫瑞林）

  注：上圖測(cè)試出的分子中最遠(yuǎn)距離原子間的距離為170?以上。

（上述三個(gè)多肽的原子間距均是通過(guò)MOE能量最小優(yōu)化后測(cè)得的原子間距）

從上述三個(gè)多肽可以看出，隨著分子量的增加，其空間結(jié)構(gòu)變得更大。對(duì)于僅11個(gè)氨基酸組成的依來(lái)多辛來(lái)說(shuō)，其僅一個(gè)方向上原子間距較大（36?），而對(duì)于鮭降鈣素來(lái)說(shuō)，其多個(gè)方向上的原子間距達(dá)到30?以上，對(duì)于更大體積的替莫瑞林來(lái)說(shuō)，其最大原子間距已達(dá)到了170?以上。當(dāng)然，上述幾個(gè)多肽僅作為例子，便于大家的理解，實(shí)際上，在溶液中的分子可能具有更小的能量及更小的空間結(jié)構(gòu)。

分子空間結(jié)構(gòu)的大小決定了分析過(guò)程當(dāng)中色譜柱孔徑的篩選。

  對(duì)于反相色譜來(lái)說(shuō)，通常具有從60~300?孔徑的填料。我們知道，保留行為的發(fā)生都發(fā)生在多孔填料的表面上，而對(duì)于多孔材料來(lái)說(shuō)，絕大多數(shù)（>95%）的表面積都分布在小孔內(nèi)部，也即絕大多數(shù)的保留分離行為都發(fā)生在多孔材料的孔內(nèi)。要形成有效的保留，首要的一點(diǎn)就是待分離組分能順利的進(jìn)入孔內(nèi)。

然而，待分離分子在孔內(nèi)的摩擦系數(shù)較大，會(huì)降低進(jìn)入孔內(nèi)的樣品分子的擴(kuò)散，使得柱效降低，所以一般要求孔徑要大于樣品分子直徑的4倍以上，才能保證樣品分子能自由出入孔內(nèi)，而維持正常的譜峰展寬。

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