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T淋巴細(xì)胞對(duì)抗原的細(xì)胞毒性作用已經(jīng)被用來攻克癌癥，在腫瘤治療中已經(jīng)成為了研究熱點(diǎn)。T細(xì)胞相關(guān)的基礎(chǔ)科學(xué)知識(shí)已經(jīng)從分子和細(xì)胞生物學(xué)角度被越來越多的研究所發(fā)現(xiàn)，也因此而產(chǎn)生了很多新的方法與腫瘤作斗爭，其中包括免疫檢查點(diǎn)，過繼細(xì)胞療法和腫瘤疫苗。 在2020年5月20日一篇發(fā)表在 Nature Reviews Immunology（IF：44.02）期刊的綜述中，著重強(qiáng)調(diào)了T細(xì)胞在現(xiàn)代癌癥免疫治療中的作用，并討論了三種不同的腫瘤免疫療法：免疫檢查點(diǎn)抑制劑，過繼性細(xì)胞療法和癌癥疫苗。在本篇文章中我們先來看看免疫檢查點(diǎn)抑制劑的相關(guān)內(nèi)容，一種重啟T細(xì)胞免疫活力的方法。 T細(xì)胞上行是免疫抑制作用的受體，也就是我們通常說的免疫“剎車”作用，這些位點(diǎn)可以用來做“檢查點(diǎn)分子”來調(diào)節(jié)免疫作用。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4（CTLA-4）和程序性細(xì)胞死亡受體1（PD-1）便是T細(xì)胞上研究中最多的免疫檢查點(diǎn)分子。它們在T細(xì)胞的不同生命周期里進(jìn)行表達(dá)并發(fā)揮生物學(xué)功能，是相互補(bǔ)充的，但又同時(shí)確保了T細(xì)胞的應(yīng)答和保持自我的耐受性，進(jìn)而有效的保護(hù)人體免受病原體侵害和腫瘤的形成。CTLA-4和PD-1已被多個(gè)研究小組成功用作治療各種難治性癌癥的研究對(duì)象，該研究最終為James P.Allison和Tasuku Honjo贏得了2018年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。在發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞上免疫共刺激分子CD28后，研究學(xué)者們也同樣發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與CD28受體具有相似結(jié)構(gòu)且生化功能相似的受體CTLA-4，進(jìn)而被鑒定為新的免疫球蛋白超家族成員。CTLA-4和CD28的基因被發(fā)現(xiàn)位于染色體的相同位置（2q33.2）并在造血區(qū)域選擇性表達(dá)。但是，與CD28在T細(xì)胞上的組成型高水平表達(dá)不同，CTLA-4通常在T細(xì)胞上的表達(dá)量較低，當(dāng)被抗原激活時(shí)才會(huì)發(fā)生高水平誘導(dǎo)性表達(dá)。有趣的是，對(duì)于Treg細(xì)胞（CD4+CD25+）一種發(fā)揮免疫抑制作用的細(xì)胞，CTLA-4在其上確是組成型的表達(dá)。在結(jié)構(gòu)上，CTLA-4和CD28 都具有形成膜結(jié)合的同型二聚體，其包含胞外區(qū)免疫球蛋白樣的結(jié)構(gòu)域，跨膜區(qū)和能募集信號(hào)蛋白并控制表面表達(dá)的胞質(zhì)區(qū)。由于CTLA-4和CD28的胞外結(jié)合區(qū)具有相似的序列，因此它們均可以與抗原呈遞細(xì)胞上的配體B7-1（或稱CD80）和B7-2（或稱CD86）進(jìn)行結(jié)合。但是CTLA-4相較CD28與B7配體的結(jié)合的親和力更高，這使得它們在生物學(xué)功能上存在了差異。隨著對(duì)CD28和CTLA-4的進(jìn)一步研究，兩者的作用功能越來越清晰。它倆具有相反的免疫調(diào)節(jié)功能。例如，研究發(fā)現(xiàn)在含有可溶性CTLA-4的環(huán)境中培養(yǎng)T細(xì)胞和表達(dá)B7分子的APC細(xì)胞，CTLA-4可以與CD28發(fā)生競爭，進(jìn)而與B7配體結(jié)合抑制T細(xì)胞的增殖。在體內(nèi)，CTLA-4的負(fù)調(diào)節(jié)作用也同樣存在。在敲除了CTLA-4的小鼠中會(huì)發(fā)生T細(xì)胞介導(dǎo)的淋巴增生性自身免疫性疾病。這種因缺乏CTLA-4引起的自身免疫性淋巴增生性疾病，主要是由于CD28的活性所導(dǎo)致。當(dāng)小鼠模型中的CD28細(xì)胞內(nèi)區(qū)域發(fā)生突變時(shí)，該疾病可以得到消除。另外，研究發(fā)現(xiàn)CTLA-4功能不全的人會(huì)表現(xiàn)出相似的嚴(yán)重多器官淋巴細(xì)胞浸潤和自身免疫性疾病，可以通過FDA批準(zhǔn)的CTLA4-Ig進(jìn)行治療。CTLA-4可以通過多種機(jī)制來抑制T細(xì)胞的活性：
除了在活化的常規(guī)T細(xì)胞中發(fā)揮功能外，Treg細(xì)胞上CTLA4的表達(dá)也有著直接和間接的免疫抑制功能。體外研究表明，CTLA4是Treg細(xì)胞釋放抗炎細(xì)胞因子所必需的，可減少附近常規(guī)T細(xì)胞的多克隆激活和增殖。除了直接的免疫抑制作用外，Treg細(xì)胞還通過結(jié)合APC上的B7配體，將其內(nèi)在化和降解的方式引發(fā)樹突細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞的活力喪失，該過程被稱為反內(nèi)吞作用。 CTLA-4作為T細(xì)胞抑制作用的調(diào)節(jié)分子，那么通過阻止CTLA-4的作用是否可以釋放T細(xì)胞的活性來針對(duì)癌癥的治療呢？研究者們通過在小鼠模型中加入抗CTLA-4的抗體，發(fā)現(xiàn)其對(duì)結(jié)腸癌和纖維肉瘤具有抗腫瘤的能力。另外研究發(fā)現(xiàn)通過CTLA-4抗體的加入能夠快速清除免疫逃逸的腫瘤細(xì)胞，進(jìn)一步證明阻斷CTLA-4分子可以產(chǎn)生長效的免疫記憶功能。盡管以CTLA-4為單一靶點(diǎn)的療法在腦，卵巢，膀胱，結(jié)腸，前列腺和軟組織腫瘤中顯示出了不錯(cuò)的療效，但是對(duì)于免疫原性較低的癌腫卻沒有得到良好的應(yīng)答。此外，癌癥模型之間的異質(zhì)性也會(huì)導(dǎo)致得到不一致結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，較大的腫瘤負(fù)荷也會(huì)減弱對(duì)CTLA-4抗體治療的應(yīng)答情況，這是由于大的腫瘤會(huì)形成更強(qiáng)大的抗炎性腫瘤微環(huán)境所導(dǎo)致。盡管在臨床研究中CTLA-4取得了喜憂參半的結(jié)果，但在針對(duì)黑色素瘤的治療中是證明有效的。Ipilimumab是一種人源的IgG1κ抗CTLA-4的單克隆抗體藥物，長期生存數(shù)據(jù)分析表明，接受Ipilimumab治療的晚期黑色素瘤患者中有22%的患者可以獲得3年甚至更長的生存時(shí)間。這種長期生存獲益的分析已經(jīng)證實(shí)，CTLA-4可以持久性的發(fā)揮免疫抗腫瘤的作用。但遺憾的是，與黑色素瘤相比，腎細(xì)胞癌，非小細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺癌和前列腺癌的結(jié)果并不理想。Tremelimumab也是一種CTLA-4抑制劑，但抗體類型為IgG2，目前尚未獲得FDA的批準(zhǔn)，因?yàn)檠芯堪l(fā)現(xiàn)該藥物并不會(huì)增加晚期黑色素瘤的存活率。據(jù)推測，這可能是由于它與Ipilimumab在結(jié)合動(dòng)力學(xué)的差異以及抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）差異所導(dǎo)致的。CTLA-4介導(dǎo)的腫瘤消退機(jī)制是多效性的，但受T淋巴細(xì)胞的作用所統(tǒng)一。T細(xì)胞的應(yīng)答效應(yīng)對(duì)于CTLA-4靶向藥物的治療效果是必不可少的，因?yàn)樵谇捌诘膭?dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞的耗竭會(huì)消除其抗腫瘤作用。CTLA-4抑制劑增強(qiáng)了T細(xì)胞對(duì)新抗原的克隆反應(yīng)，這預(yù)示著抗CTLA-4療法具有良好的響應(yīng)。除了增強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞的反應(yīng)外，在小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)抗CTLA-4治療還會(huì)通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（ADCC）耗盡局部腫瘤內(nèi)的Treg細(xì)胞，進(jìn)而平衡了腫瘤免疫微環(huán)境中的抑制作用。但這種現(xiàn)象仍然需要在人類的癌癥中得到進(jìn)一步的研究證實(shí)。盡管CTLA-4抑制劑的加入可以促使效應(yīng)T細(xì)胞和Treg細(xì)胞的協(xié)同作用進(jìn)而增強(qiáng)抗腫瘤能力，但是這兩種細(xì)胞在賦予臨床療效方面仍存在爭議。總體而言，目前的數(shù)據(jù)表明，預(yù)測臨床結(jié)局的最關(guān)鍵因素是效應(yīng)T細(xì)胞與Treg細(xì)胞在腫瘤浸潤區(qū)的比例。PD-1與CTLA-4相似，對(duì)免疫系統(tǒng)的過度活化起著抑制的作用。作為免疫球蛋白超家族中的一種1型跨膜糖蛋白，PD-1與CTLA-4和CD28分別具有20%和15%的氨基酸一致性。人類的PD-1在TCR受到刺激后會(huì)在T細(xì)胞上表達(dá)，并與組成型存在于APC上的PD-L1（也稱B7-H1）和PD-L2（也稱B7-DC）結(jié)合。動(dòng)物試驗(yàn)表明，PD-1在對(duì)T細(xì)胞的調(diào)節(jié)上與CTLA-4具有很大的差別。在空間上，CTLA-4主要在淋巴器官內(nèi)發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用，而PD-1則傾向于在周圍組織內(nèi)局部調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化，且在T細(xì)胞的活化過程中PD-1起作用較晚?？傮w而言，PD-1在維持T細(xì)胞對(duì)自身的免疫耐受方面發(fā)揮著獨(dú)特的作用。研究發(fā)現(xiàn)，PD-1主要通過在效應(yīng)T細(xì)胞和Treg細(xì)胞內(nèi)的抑制性信號(hào)來發(fā)揮免疫抑制作用。這類信號(hào)主要是基于免疫受體酪氨酸的開關(guān)基序和免疫受體酪氨酸的抑制基序，通過募集磷酸酶進(jìn)行去磷酸化來發(fā)揮作用。CTLA-4和PD-1都可以通過抑制蛋白激酶B的信號(hào)通路來減少葡萄糖的攝入和利用，前者主要通過PP2A來實(shí)現(xiàn)，后者主要通過減弱PI3K的活力來實(shí)現(xiàn)。與CTLA-4相比，PD-1通路對(duì)于控制效應(yīng)分子的持續(xù)激活和增殖至關(guān)重要。當(dāng)PD-1與其配體結(jié)合后，它可以誘導(dǎo)T細(xì)胞功能障礙，該現(xiàn)象稱為T細(xì)胞耗竭。但是，在什么情況下PD-1是調(diào)節(jié)細(xì)胞的耗竭還是凋亡呢？這目前仍然是一個(gè)正在研究中的問題。除了調(diào)節(jié)常規(guī)的T細(xì)胞外，研究發(fā)現(xiàn)APC上的PD-L1還可以控制Treg細(xì)胞的分化和其免疫抑制的活性。但不幸的是腫瘤細(xì)胞恰恰利用了這些原理，通過上調(diào)自身的PD-L1蛋白來誘導(dǎo)T細(xì)胞的耗竭并同時(shí)產(chǎn)生促進(jìn)腫瘤生長和侵襲的微環(huán)境。在臨床前研究中，PD-1通路已經(jīng)被證實(shí)可用于癌癥的治療。首先在動(dòng)物模型中的結(jié)果顯示，過表達(dá)PD-L1或PD-L2的癌細(xì)胞限制了CD8+T的細(xì)胞毒性作用及抗腫瘤反應(yīng)，通過加入PD-1抑制劑可以恢復(fù)CD8+T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用以及限制腫瘤的轉(zhuǎn)移。在臨床前的實(shí)驗(yàn)成功后，研究者們相繼研發(fā)出了依賴于PD-1/PD-L1通路相關(guān)的單克隆抗體藥物。在2010年，一項(xiàng)I期臨床試驗(yàn)表明，PD-1抑制劑具有良好的耐受性和抗腫瘤反應(yīng)。在2014年，人源化和完全人源化的抗PD-1單抗pembrolizumab和nivolumab（同為IgG4亞類）被FDA批準(zhǔn)用于難治性且無法切除的黑色素瘤的治療。在2015年，pembrolizumab被批準(zhǔn)用于PD-L1陽性的非小細(xì)胞肺癌患者的治療。隨后pembrolizumab和nivolumab在越來越多的癌腫中被獲批。與CTLA-4療法相似，長期生存分析表明，PD-1阻斷后，免疫介導(dǎo)的生存獲益是持久的。并且，PD-1抑制劑顯示出了比抗CTLA-4治療更廣泛的臨床效果，但是其中的原因還尚不清楚。據(jù)推測，這種差異可能是由于PD-1/PD-L1通路是由腫瘤介導(dǎo)所發(fā)生的免疫逃逸，而CTLA-4卻是人體所擁有的正常免疫調(diào)節(jié)通路。與此同時(shí)，PD-L1也被證明在多種癌癥中可以作為有效治療的特異性靶點(diǎn)。在2016年，第一個(gè)靶向PD-L1的人源化單克隆抗體atezolizumab（IgG1亞類）被批準(zhǔn)用于治療尿路上皮癌。此后該藥物的適應(yīng)癥得到進(jìn)一步的擴(kuò)大。其他抗PD-L1的人類單克隆抗體還包括avelumab和durvalumab，已于2017年進(jìn)入市場。因此，與PD-1抑制劑相似，對(duì)PD-L1的阻斷已在難以治療的癌癥中顯示了良好的效應(yīng)。02 免疫檢查點(diǎn)的不良反應(yīng)免疫檢查點(diǎn)強(qiáng)大的效應(yīng)功能，可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)自身組織的免疫攻擊作用。對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行薈萃分析發(fā)現(xiàn)，預(yù)計(jì)有15-90%的患者發(fā)生了與免疫相關(guān)的不良事件。在CTLA-4和PD-1/PD-L1抑制劑治療中分別觀察到有30%和15%的患者發(fā)生了需要干預(yù)的嚴(yán)重不良反應(yīng)。常見的免疫毒性特征是初始T細(xì)胞的丟失和過度活躍的記憶T細(xì)胞的積累，這些T細(xì)胞會(huì)侵襲胃腸道和肺等周圍器官，并引起炎癥性損傷。其中角質(zhì)化和非角質(zhì)化的黏膜似乎最敏感，分別約有68%和40%的患者出現(xiàn)了瘙癢和黏膜炎。其中抗CTLA-4療法更常見于胃腸道和大腦的毒性反應(yīng)，而抗PD-1/PD-L1療法的患者發(fā)生甲狀腺功能減退，肝毒性和肺炎的風(fēng)險(xiǎn)較高。然而，隨著免疫檢查點(diǎn)治療的適應(yīng)癥的數(shù)量增多以及治療患者越來越多，在更多的器官發(fā)生副作用的情況也越來越多，同時(shí)免疫治療的異質(zhì)性響應(yīng)也越來越明顯。目前，已經(jīng)開發(fā)了多種免疫相關(guān)的反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，以期更好地將患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的反應(yīng)進(jìn)行分類。這些標(biāo)準(zhǔn)很大的一個(gè)目的是為了區(qū)分PD-1或CTLA-4治療所帶來的假性進(jìn)展?？偠灾?，免疫檢查點(diǎn)抑制劑已經(jīng)被證實(shí)具有會(huì)導(dǎo)致自身免疫毒性的發(fā)生，并伴有特定器官發(fā)生毒性的模式。因此，越來越多的研究開始通過修飾現(xiàn)有抗體和設(shè)計(jì)新的傳遞方式來改善免疫檢查點(diǎn)抑制劑的副作用和臨床響應(yīng)。例如：對(duì)抗體進(jìn)行pH敏感修飾，可以有效限制不良事件的發(fā)生以及提高臨床反應(yīng)結(jié)果。另外一些研究顯示改變免疫檢查點(diǎn)抑制劑局部給藥的生物材料可以有效增強(qiáng)耐受性和提高抗腫瘤應(yīng)答。總之，當(dāng)前廣泛的研究正在探索減少免疫檢查點(diǎn)療法相關(guān)毒性的同時(shí)增加多種腫瘤中的獲益方法。除了從藥物本身出發(fā)來降低生物毒性，對(duì)于預(yù)測免疫不良反應(yīng)的生物標(biāo)志物的研究也是十分火熱。一項(xiàng)研究表明通過測量膽汁糖蛋白CEACAM1和細(xì)胞表面蛋白CD177表達(dá)的增加來衡量中性粒細(xì)胞的活化，與ipilimumab治療所導(dǎo)致的胃腸道相關(guān)副作用有關(guān)。另外一些研究顯示，無論受影響的器官如何，嗜酸性粒細(xì)胞的增加和促炎性細(xì)胞因子IL-17的釋放均與毒性有關(guān)。總之，最美好的愿望是通過遺傳學(xué)，生物化學(xué)或是代謝譜分析可以預(yù)篩查或快速檢測出免疫檢查點(diǎn)藥物對(duì)個(gè)體可能發(fā)生的不良反應(yīng)。由于癌癥病發(fā)的多樣性，異質(zhì)性以及免疫療法激動(dòng)人心的進(jìn)步。越來越多的新興的免疫療法被開發(fā)，以解決癌癥發(fā)病機(jī)制和靶向的復(fù)雜性。在免疫檢查點(diǎn)抑制劑單一療法取得臨床成功之后，各種研究發(fā)現(xiàn)將具有不同作用機(jī)制的藥物結(jié)合起來的聯(lián)合療法在各種癌癥中的治療成功率都有所提高。例如，F(xiàn)DA獲批的ipilimumab和nivolumab聯(lián)合治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和晚期腎癌。但是，也正如預(yù)期的那樣，聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)的療法也會(huì)增加藥物引起的毒性反應(yīng)。放射療法與免疫檢查點(diǎn)抑制劑結(jié)合是頑固性腫瘤的另一種治療選擇。從機(jī)理上講，放療在免疫調(diào)節(jié)的作用中是一把雙刃劍，放療通過暴露新抗原增強(qiáng)了抗腫瘤T細(xì)胞的多樣性，但同時(shí)也通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上的PD-L1表達(dá)減弱了免疫反應(yīng)。因此，在臨床前數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，放療與PD-1/PD-L1抑制劑的組合代表了一種具有吸引力的協(xié)同組合。轉(zhuǎn)移性癌癥患者可能是這種聯(lián)合用藥的目標(biāo)人群。總而言之，雙重免疫檢查點(diǎn)抑制劑以及放療聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑的多重療法顯示了協(xié)同反應(yīng)的光明前景，因?yàn)檫@些藥物組合顯示除了獨(dú)特且互補(bǔ)的藥效學(xué)。免疫檢查點(diǎn)抑制劑在癌癥中的良好效果，促使了越來越多的學(xué)者開始新型免疫靶點(diǎn)的研究。其中包括淋巴細(xì)胞活化基因3（LAG3），T細(xì)胞免疫球蛋白3（TIM3），T細(xì)胞活化V結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白抑制劑（VISTA），B7-H3和T細(xì)胞免疫球蛋白ITIM結(jié)構(gòu)域（TIGIT）。LAG3是一種抑制性配體在活化的T細(xì)胞以及Treg細(xì)胞上表達(dá)，可以阻斷CD4細(xì)胞上的MHCII類分子的接觸點(diǎn)來降低T細(xì)胞的活化作用。它通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期的停滯來防止T細(xì)胞的過度擴(kuò)增。與PD-1一樣，LAG3是T細(xì)胞衰竭的標(biāo)志物，在浸潤性免疫淋巴細(xì)胞上的表達(dá)情況預(yù)示著臨床預(yù)后的結(jié)果可能較差。目前，已開發(fā)出了相關(guān)阻斷藥物，包括LAG3：Ig融合蛋白以及靶向LAG3單克隆抗體。TIM3也是T細(xì)胞反應(yīng)的另一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)劑。與LAG3一樣抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程。它的上調(diào)可能導(dǎo)致了PD-1藥物的抗藥性，使得聯(lián)合治療成為了提高PD-1抑制劑效果的強(qiáng)力選擇。類似于TIM3，VISTA是顯示出與當(dāng)前免疫檢查點(diǎn)抑制劑抗藥性相關(guān)的另一種分子，并在小鼠模型中顯示了與抗PD-1療法的協(xié)同作用。B7-H3同樣是一個(gè)對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)分子。它在許多的腫瘤類型中都高度表達(dá)。在針對(duì)多種腫瘤類型的I期臨床研究中，Enobituzumab（一種針對(duì)B7-H3的人源化單克隆抗體）可有效誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)。另有TIGIT也是一種抑制T細(xì)胞過度活化的靶點(diǎn)，由于它在腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞中更穩(wěn)定的表達(dá)，使得其相比其它檢查點(diǎn)分子更具特異性，也成為了更有吸引力的靶點(diǎn)。除了上述提到的這些抑制性的免疫檢查點(diǎn)。刺激T細(xì)胞的共刺激受體，包括誘導(dǎo)型刺激物（ICOS），腫瘤壞死因子受體超家族成員4（TNFRSF4，也稱CD34），腫瘤壞死因子受體超家族成員9（TNFRSF9，也稱4-1BB）等，也實(shí)現(xiàn)了有效的免疫治療作用。專注于T細(xì)胞的癌癥免疫療法已經(jīng)成為抗癌武器中的強(qiáng)大工具。但是，這是經(jīng)過了多年的基礎(chǔ)科學(xué)發(fā)現(xiàn)和臨床轉(zhuǎn)化，才明確證明了免疫系統(tǒng)治療癌癥的能力。進(jìn)一步研究T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞的調(diào)控功能，可能會(huì)讓我們能夠更好的增強(qiáng)這種方法的功能。在“難以治療”的腫瘤中，免疫檢查點(diǎn)抑制劑的臨床結(jié)果遠(yuǎn)高于有效的化學(xué)療法。盡管與免疫相關(guān)的不良反應(yīng)很常見，但是這些免疫療法比傳統(tǒng)化療耐受性更好。上述我們敘述的癌癥免疫療法的成功案例突顯了基礎(chǔ)學(xué)科研究與臨床實(shí)踐之間的內(nèi)在聯(lián)系。并且說明了建立在堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)學(xué)科之上的從實(shí)驗(yàn)室到臨床的轉(zhuǎn)化，是一種攻克人類可怕疾病的有效方法。
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