【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>
1.掌握質(zhì)粒提取的基本方法的原理；
2.學(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶的使用方法。
【實(shí)驗(yàn)原理】
重組克隆的篩選和鑒定是基因工程中的重要環(huán)節(jié)之一。不同的克隆載體和相應(yīng)的宿主系統(tǒng)，其重組克隆的篩選和鑒定方法不盡相同。從理論上說，重組克隆的篩選是排除自身環(huán)化的載體、未酶解完全的載體以及非目的DNA片斷插入的載體所形成的克隆。常用的篩選方法有兩類。一類是針對遺傳表型改變篩選法，以β－半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選法為代表。另一類是分析重組子結(jié)構(gòu)特征的篩選法，包括快速裂解菌落鑒定質(zhì)粒大小、限制酶圖譜鑒定、Southern 印跡雜交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位雜交等方法。

1．β－半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選法（藍(lán)白斑篩選法）
使用本方法的載體包括M13噬菌體、pUC質(zhì)粒系列、pGEM質(zhì)粒系列等。這些載體的共同特征是載體上攜帶一段細(xì)菌的基因lacZ。lacZ編碼β－半乳糖苷酶的一段146個(gè)氨基酸的β肽，載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞為lacZ△M15基因型。重組子由于外源片斷的插入使β肽基因失活不能形成互補(bǔ)作用，也就是說，宿主細(xì)胞表現(xiàn)為β－半乳糖苷酶失活。因此，在X-gal平板上，重組克隆為無色噬菌斑或菌落，非重組克隆為藍(lán)色噬菌斑或菌落。這種篩選方法操作簡單，但當(dāng)插入片斷較短（小于500bp），且插入片斷沒有影響lacZ基因的讀框時(shí)，有假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

2．快速裂解菌落鑒定質(zhì)粒大小
從平板中挑取菌落，過夜培養(yǎng)后裂解，直接進(jìn)行凝膠電泳，與載體DNA比較，根據(jù)遷移率的減小初步判斷是否有插入片斷存在。本方法適用于插入片斷較大的重組子的初步篩選。

3．限制酶圖譜鑒定
對于初步篩選具有重組子的菌落，提純重組質(zhì)粒或重組噬菌體DNA，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶（一種或兩種）切割重組子釋放出的插入片斷，對于可能存在雙向插入的重組子還可用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化鑒定插入方向，然后用凝膠電泳檢測插入片斷和載體的大小。

4．Southern 印跡雜交
為確定DNA插入片斷的正確性，在限制性內(nèi)切酶消化重組子、凝膠電泳分離后，通過Southern印跡轉(zhuǎn)移將DNA移至硝酸纖維膜上，再用放射性同位素或非放射性標(biāo)記的相應(yīng)外源DNA片斷作為探針，進(jìn)行分子雜交，鑒定重組子中的插入片斷是否是所需的靶基因片斷。

5．PCR法
用PCR對重組子進(jìn)行分析，不但可以迅速擴(kuò)增插入片段，而且可以直接進(jìn)行DNA序列分析。因?yàn)閷τ诒磉_(dá)型重組子，其插入片斷的序列的正確性是非常關(guān)鍵的。PCR法既適用于篩選含特異目的基因的重組克隆，也適用于從文庫中篩選含感興趣的基因或未知的功能基因的重組克隆。前者采用特異目的基因的引物，后者采用載體上的通用引物。

6．菌落（或噬菌斑）原位雜交
菌落或噬菌斑原位雜交技術(shù)是將轉(zhuǎn)化菌DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，用放射性同位素或非放射性標(biāo)記的特異DNA或RNA探針進(jìn)行分子雜交，然后挑選陽性克隆。這種方法能進(jìn)行大規(guī)模操作，是篩選基因文庫的首選方法。

本實(shí)驗(yàn)采用限制酶圖譜鑒定。
核酸限制性內(nèi)切酶是在原核生物中發(fā)現(xiàn)的一類專一識別雙鏈DNA中特定堿基序列的核酸水解酶，它們的功能類似于高等動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，用于抗擊外來DNA的侵襲?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)幾百種限制性內(nèi)切酶，分子生物學(xué)中經(jīng)常使用的是II型限制性內(nèi)切酶，它能識別雙鏈DNA分子中特定的靶序列（4～8bp）, 以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5＇端為P，3＇端為OH。由于限制性內(nèi)切酶能識別DNA 特異序列并進(jìn)行切割，因而在基因重組、DNA序列分析、基因組甲基化分析、基因物理圖譜繪制及分子克隆等技術(shù)中收到廣泛應(yīng)用。酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在最適反應(yīng)條件下，1小時(shí)完全降解1μg DNA的酶量為一個(gè)單位。

【試劑與器材】
（一）試劑
1.質(zhì)粒提取試劑
2.限制性內(nèi)切酶Kpn I 及10×酶切緩沖液。
3.限制性內(nèi)切酶Xbal I及10×酶切緩沖液。
4.TAE電泳緩沖液或TBE電泳緩沖液
5.瓊脂糖（Agarose）
6.6×電泳加樣緩沖液：0.25％ 溴粉藍(lán)，40％(w/v) 蔗糖水溶液，貯存于 4℃。

（二）器材

水平電泳裝置、電泳儀、水浴鍋、恒溫振蕩器、臺式高速離心機(jī)、微量移液器、凝膠成像系統(tǒng)等。

（三）菌株
大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化菌。

【操作方法】
1. 質(zhì)粒提取步驟
2. 酶切反應(yīng)
1)在滅菌的0.5mL EP管中加入重組質(zhì)粒DNA 1μg和相應(yīng)的10×M buffer 2μL（見附錄1），再加入滅菌重蒸水至酶切總體積為20μL，將管內(nèi)溶液混勻后各加入1μLKpn I和Xbal I酶液雙酶切，用手指輕彈管壁使溶液混勻或用微量離心機(jī)甩一下，使溶液集中在管底。如果是同一條件下進(jìn)行多個(gè)酶切反應(yīng)，建議統(tǒng)一加好相同的組分后混勻分裝，最后加入DNA樣品。
酶切反應(yīng)加樣表：
2)混勻反應(yīng)體系后，將EP管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?7℃水浴保溫2h-3h，使酶切反應(yīng)完全。
3)每管加入2μL 0.1mol/L EDTA (pH8.0)，混勻，以停止反應(yīng)，或置65℃水浴中10min，對限制性內(nèi)切酶進(jìn)行滅活，不同的酶滅活條件可能不同，可參照說明書進(jìn)行。滅活后的酶切溶液置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>
4)瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切反應(yīng)的結(jié)果。

【注意事項(xiàng)與提示】
1.影響限制性內(nèi)切酶活性的因素包括：
a)酶切割位點(diǎn)周圍核苷酸兩側(cè)的堿基的性質(zhì)；
b)識別序列在DNA中的分布頻率；
c)與DNA的構(gòu)象有關(guān)（SC,L,OC）；
d)DNA的純度（蛋白、氯仿、SDS、EDTA、甘油等）
因此，酶切時(shí)應(yīng)盡量注意將影響酶切的因素降低到最小。

2．2.市售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時(shí)可事先用酶反應(yīng)緩沖液（1×）進(jìn)行稀釋；可采取適當(dāng)延長酶切時(shí)間或增加酶量的方式提高酶切效率，但內(nèi)切酶用量不能超過總反應(yīng)體積的10%，否則，酶活性將因?yàn)楦视瓦^量受到影響。

3.由于EDTA的存在會(huì)抑制連接酶的活性，通常采用加熱方法終止酶切反應(yīng)。

4.酶切反應(yīng)的整個(gè)過程應(yīng)注意槍頭的潔凈以避免造成對酶的污染，為防止酶活性降低，取酶時(shí)應(yīng)在冰上操作且動(dòng)作迅速。