簡(jiǎn)介和前期文章

我對(duì)之前的所有教程進(jìn)行了再次詳細(xì)的總結(jié)

前言：

每當(dāng)我們接觸新事物時(shí)，都忍不住問(wèn)如下圖所示之哲學(xué)三問(wèn)（當(dāng)然有時(shí)候問(wèn)的是，這是什么？可以吃嗎？怎么做？）：

CRISPRCas91.png

由于我們是實(shí)驗(yàn)教程，因此便不再詳細(xì)介紹CRISPR/Cas9的細(xì)節(jié)，在這里只做一個(gè)大概的介紹，主要材料為最近整理的思維導(dǎo)圖。溫馨提示：如果不需要了解背景知識(shí)，可直接跳到第4點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)方案正文部分。

1. 是何物？

1.1 CRISPR
CRISPR是古細(xì)菌及細(xì)菌抵抗病毒的機(jī)制，當(dāng)病毒攻擊細(xì)菌時(shí)，細(xì)菌將該病毒的部分DNA整合到自身基因內(nèi)組成CRISPR，當(dāng)下次該病毒再次來(lái)襲之時(shí)，CRISPR轉(zhuǎn)錄的crRNA可通過(guò)堿基互補(bǔ)識(shí)別外源性DNA并激活Cas核酸內(nèi)切酶的DNA切割活性，由此殺傷病毒。
1.2 CAS即為CRISPR相關(guān)的核酸內(nèi)切酶，有多個(gè)亞型
1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)

image.png

### 2. 有何用
2.1 在細(xì)菌中主要抵抗外來(lái)病毒的侵襲，略；
2.2 在實(shí)際應(yīng)用中，設(shè)計(jì)特異性的CRISPR識(shí)別片段，可幫助靶向編輯基因，具體可見(jiàn)下圖，詳細(xì)機(jī)制可參考張峰組論文：[Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system]
(https://www./articles/nprot.2013.143)

image.png

3. 如何用

在這里我們使用CRISPR/Cas9直接敲除為例，介紹實(shí)驗(yàn)方案和過(guò)程，如想更詳細(xì)了解，可查閱上文提到的張峰組論文：[Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system]
(https://www./articles/nprot.2013.143)

根據(jù)上文我們已知，CRISPR/Cas系統(tǒng)一共有CRISPR和Cas9兩個(gè)部件組成，因此：

4. 實(shí)驗(yàn)方案正文

CRISPR/Cas9的實(shí)驗(yàn)方案有很多種，但最終目的都是一樣的，即將靶向結(jié)合到目的基因的sgRNA及Cas9核酸內(nèi)切酶導(dǎo)入到細(xì)胞中，達(dá)到基因編輯的效果。

根據(jù)sgRNA及Cas9的產(chǎn)生、投遞方式的不同，有諸多不同的實(shí)驗(yàn)方案。在這里我的方案是，將sgRNA插入到含有Cas9的質(zhì)粒中，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，讓細(xì)胞同時(shí)表達(dá)sgRNA及Cas9，達(dá)到基因編輯的效果。

4.1 確定靶基因--因人而異

4.2 gRNA設(shè)計(jì)（特異性識(shí)別靶基因的序列）-- 0.5 h~半天

這里以非常常見(jiàn)的P53基因?yàn)槔?，過(guò)一遍gRNA設(shè)計(jì)流程。

（1）NCBI網(wǎng)頁(yè)下載P53基因序列

點(diǎn)擊GenBank

下載序列

（2） 用SnapGene軟件打開(kāi)序列， 分析敲除位點(diǎn)。

敲除所有剪接體共有的外顯子序列

鼠標(biāo)懸停目標(biāo)外顯子，查看詳細(xì)信息，得知第一個(gè)segment（片段）是從12417-12498，一共82 bp；在Sequence中查看，復(fù)制一整個(gè)segment的堿基序列

segment堿基序列atggccatctacaagcagtcacagcacatgacggaggttgtgaggcgctgcccccaccatgagcgctgctcagatagcgatg

（3）設(shè)計(jì)sgRNA

一般選擇網(wǎng)頁(yè)工具設(shè)計(jì)即可： https://o/guide-design-resources （張峰實(shí)驗(yàn)室），打開(kāi)網(wǎng)頁(yè)，選擇網(wǎng)頁(yè)工具--博德研究所

粘貼序列，選擇化膿性鏈球菌（NGG）即Cas9，人類(lèi)基因組

查看結(jié)果

對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷，選擇合適的序列：

![img]

小彩蛋

快捷方案：可以購(gòu)買(mǎi)已經(jīng)合成好的sgRNA+質(zhì)粒（土豪請(qǐng)隨意）

尋找現(xiàn)成的CRISPR/Cas9敲除細(xì)胞系，在信息介紹中找到公司使用的gRNA，例如：

以上我們完成了對(duì)CRISPR/Cas9的簡(jiǎn)單了解及gRNA的在線設(shè)計(jì)，由于篇幅較長(zhǎng)，將在下一次補(bǔ)充gRNA設(shè)計(jì)之后的驗(yàn)證事項(xiàng)和質(zhì)粒構(gòu)建的方案，感謝關(guān)注，繼續(xù)學(xué)習(xí)，拜拜~