綜述-植物m6A甲基化酶功能進(jìn)化及調(diào)控機(jī)制

2019年5月，著名的小麥育種專家，來自西北農(nóng)林科技大學(xué)作物遺傳國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的宋衛(wèi)寧教授，在著名植物學(xué)期刊PBJ發(fā)表了植物m6A的最新綜述。這是迄今為止第一篇在植物方面最為完整的m6A綜述，從甲基化酶的種類、基因的家族進(jìn)化以及下游功能做了詳細(xì)的描述。

聯(lián)川生物將全文主要內(nèi)容進(jìn)行翻譯，版權(quán)歸宋教授團(tuán)隊(duì)所有，目的旨在于為植物方向進(jìn)行m6A甲基化研究的老師提供一些幫助。

摘要與總結(jié)

N6‐methyladenosine也就是我們平時(shí)所說的m6A甲基化修飾，是RNA上一種非常重要的堿基修飾之一。這種保守的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制（post-tranion）可以調(diào)控許多真核生物的遺傳信息。

近幾年，植物中mRNA的m6A修飾是全球許多課題組關(guān)注的新熱點(diǎn)。與哺乳動(dòng)物一樣，植物中也存在m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶（writers）、去甲基化酶（erasers）和甲基化閱讀蛋白（readers），這些蛋白的特征及功能是當(dāng)前植物學(xué)研究中新的方向。在可預(yù)見的未來，植物m6A的功能研究將迎來大爆發(fā)，這些基礎(chǔ)研究的突破為作物性狀改良提供強(qiáng)有力的理論支撐。

本文將系統(tǒng)分析總結(jié)近幾年來，植物m6A相關(guān)甲基化酶結(jié)構(gòu)與成分，以及這些酶在植物發(fā)育生物學(xué)、逆境脅迫應(yīng)答等方面的生物學(xué)功能。我們認(rèn)為，從進(jìn)化角度來看，不同植物中這些m6A甲基化酶都高度保守。

前言

RNA分子是所有生物的基本成分。這些分子作為載體將遺傳信息從DNA傳遞到蛋白質(zhì)，并作為各種生物過程的調(diào)節(jié)器。

RNA轉(zhuǎn)錄物可能經(jīng)歷各種復(fù)雜的化學(xué)修飾，在過去的四十多年中人們已經(jīng)在RNA中的各個(gè)階段發(fā)現(xiàn)了160多種堿基修飾，如mRNA前體和成熟體階，甚至在剪接過程發(fā)生之前都有存在RNA堿基修飾。

曾經(jīng)由于受到儀器靈敏度以及方法學(xué)的限制，mRNA的化學(xué)修飾豐度較低導(dǎo)致RNA表觀遺傳學(xué)研究被整整滯后了幾十年。檢測(cè)這種修飾的研究方法的局限性，導(dǎo)致人們忽略了這些修飾在mRNA表觀遺傳學(xué)中的重要性。

在轉(zhuǎn)錄后修飾中，m6A是最普遍的修飾之一，廣泛存在于tRNA、rRNA、mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA中。值得注意的是，在真核細(xì)胞中，m6A修飾在所有RNA堿基修飾中占比達(dá)到80%，在polyA mRNA中m6A在所有RNA堿基修飾中占到的比例也超過50%。

大約在40年前，已經(jīng)有國外的課題組首次在小麥、燕麥、胚芽鞘和玉米的RNA中發(fā)現(xiàn)m6A修飾。隨后又有其他課題組陸續(xù)在病毒、果蠅、酵母、植物、人類和其他哺乳動(dòng)物中的RNA中有鑒定到m6A修飾（液相質(zhì)譜法鑒定）。

在以前的研究中，m6A的修飾被認(rèn)為是“靜態(tài)的”和不可逆的。然而，何川教授在2011年首次發(fā)現(xiàn)FTO蛋白可以對(duì)帶有m6A修飾的腺苷有去甲基化修飾作用。

隨后，許多課題組又提出了“體外轉(zhuǎn)錄體”的概念，并逐漸擴(kuò)展到一個(gè)新的研究領(lǐng)域。在哺乳動(dòng)物中，m6A修飾比例在0.1-0.4%，相當(dāng)于每2000個(gè)核苷酸中有一個(gè)m6A修飾位點(diǎn)。據(jù)報(bào)道釀酒酵母減數(shù)分裂的發(fā)生率稍高，m6A堿基比例較高，大約為0.7-0.9%。在各種病毒中，每條RNA上m6A修飾的堿基在1-15個(gè)左右，而擬南芥中每1000個(gè)核苷酸中就有0.5-0.7個(gè)位點(diǎn)有m6A修飾（或每條轉(zhuǎn)錄本中有0.7-1個(gè)m6A位點(diǎn)）。

在植物和其他真核生物中，m6A修飾是由m6A甲基轉(zhuǎn)移酶在與RNA上的保守motif RRACH(R=G/A; H=U/A/C)結(jié)合后產(chǎn)生的。有趣的是，當(dāng)高度保守的GAC突變?yōu)镚AU時(shí)（A堿基仍然有m6A修飾但是邊上的C堿基變成了U），肉瘤病病毒mRNA不再發(fā)生m6A修飾。

m6A修飾頻率在RNA中分布不是特別均勻，在成熟的mRNA中豐度較高。這種修飾主要富集在3’ UTR和終止密碼子TES附近，尤其是CDS序列的3’端和3’UTR前端。在壓力脅迫等條件刺激下，5’UTR和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS上也有大量的m6A修飾。

在植物中，除了3’UTR和TES，部分樣本在5’UTR和TSS附近也存在大量m6A修飾富集。超過60%的m6A修飾位于葉綠體相關(guān)蛋白基因的TSS附近，在測(cè)序結(jié)果中某些光合作用的相關(guān)基因也存在大量的m6A修飾。這些結(jié)果表明m6A修飾參與調(diào)控了光合作用。

迄今為止，m6A的研究大多集中在人類和其他哺乳動(dòng)物中，而很少有關(guān)于植物m6A的論文。此外，許多關(guān)于人類和其他哺乳動(dòng)物中的m6A文章得出的結(jié)論在植物中受到了挑戰(zhàn)。

本文首先對(duì)22種植物中的m6A writers和erasers進(jìn)行鑒定，總結(jié)在植物中RNA甲基化酶的組成和結(jié)構(gòu)。由于m6A在不同物種中高度保守，選擇擬南芥作為模型來確定其他植物物種的同源蛋白，以揭示m6A修飾潛在的分子機(jī)制。

其次，系統(tǒng)地綜述了近年來植物m6A甲基化生物學(xué)功能的研究進(jìn)展。

第三，研究了不同植物之間m6A甲基化酶之間的關(guān)系，描述了m6A在植物中甲基化酶的功能和進(jìn)化，有助于更好地理解m6A的功能，有助于揭示RNA修飾調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性。

植物m6A甲基化酶：writers、erasers和readers

圖1. 通過m6A書寫、擦除和閱讀蛋白網(wǎng)絡(luò)的作用，建立了一個(gè)m6A修飾調(diào)控?cái)M南芥基因穩(wěn)定和翻譯的示意圖——m6A甲基轉(zhuǎn)移酶（writers）和去甲基化酶（erasers）導(dǎo)致m6A基因修飾的動(dòng)態(tài)模式。m6a-writer復(fù)合物包括蛋白質(zhì)MTA、MTB、FIP37、virilizer和HAKAI。核內(nèi)的ALHBH9b和ALKBH10b蛋白可以去除m6A修飾。ECT2/3/4和CPSF30蛋白作為m6A閱讀蛋白，專門結(jié)合含有RRACH motif的m6A位點(diǎn)并介導(dǎo)特定功能。m6A甲基化在mRNA代謝、翻譯和穩(wěn)定性中的重要作用已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。ECT2調(diào)節(jié)核內(nèi)的3′UTR mRNA處理。然而ECT2在細(xì)胞質(zhì)中可以結(jié)合到含m6A的RNA，以促進(jìn)mRNA的翻譯，并將mRNA導(dǎo)入應(yīng)激顆粒，以提高應(yīng)激耐受性。另兩個(gè)閱讀蛋白ECT3/4可能調(diào)控?cái)M南芥葉片的形態(tài)發(fā)育。最后，通過酶MAPDA催化N6-MAMP轉(zhuǎn)化為IMP，可以將RNA中的m6A修飾轉(zhuǎn)化為N6-mAMP。

m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶是在轉(zhuǎn)錄后由保守motif RRACH的一類RNA結(jié)合蛋白形成復(fù)合物組成。m6A甲基化、去甲基化以及識(shí)別過程中涉及到許多蛋白，包括writers、erasers和readers。在擬南芥中writers包括MTA、MTA，erasers包括ALKBH9b、ALKBH10b，readers包括ECT2、ECT3和ECT4等。

因?yàn)閙6A水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于RRACH motif豐度，所以并不是所有RRACH motif都與m6A修飾相關(guān)，這表明調(diào)節(jié)m6A修飾的分子機(jī)制尚未被完全挖掘。

擬南芥甲基化轉(zhuǎn)移酶MTA和FIP37等可以調(diào)控頂端分生組織的發(fā)育擬南芥去甲基化酶ALKBH9b和ALKBH10b作為erasers可以對(duì)RNA上帶m6A修飾的腺嘌呤進(jìn)行去甲基化修飾反應(yīng)。

擬南芥中ECT2（具有YTH結(jié)構(gòu)域）是最重要的一個(gè)閱讀蛋白之一在mRNA的3’UTR有顯著富集。ECT2在調(diào)節(jié)細(xì)胞核中mRNA 3’UTR加工及mRNA穩(wěn)定性方面起著十分重要的作用。當(dāng)RNA從細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中，ECT2還能調(diào)控?cái)M南芥毛狀體發(fā)育（案例解析：m6A-YTH組件調(diào)控?cái)M南芥葉片發(fā)育時(shí)間和形態(tài)發(fā)生 | m6A專題）。ECT3和ECT4在擬南芥細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合m6A修飾的mRNA，與ECT2一起在不同時(shí)間點(diǎn)調(diào)控葉片形態(tài)發(fā)育起到關(guān)鍵作用。此外在熱脅迫下，擬南芥翻譯起始被抑制，ECT2會(huì)在應(yīng)激顆粒上富集，表明ECT2能控制細(xì)胞質(zhì)溶膠中mRNA的命運(yùn)。最后體內(nèi)RNA轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的N6‐methylated AMP（N6-mAMP），是由MAPDA酶通過水解反應(yīng)將其轉(zhuǎn)化為肌苷一磷酸IMP。

作為模式植物，擬南芥上的m6A相關(guān)研究由于起步較早，可以為其他植物提供參考。

m6A Writers

在哺乳動(dòng)物中鑒定的第一個(gè)m6A甲基轉(zhuǎn)移酶被命名為METTL3，并從200kDa甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物中被成功克隆出來。METTL3是S-腺苷-L-蛋氨酸（S‐adenosyl‐L‐methionine, SAM）依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶家族的一個(gè)成員，在植物和哺乳動(dòng)物中高度保守。MTA（METTL3人同源蛋白）是擬南芥中最早發(fā)現(xiàn)的甲基轉(zhuǎn)移酶之一。

進(jìn)化分析以及實(shí)驗(yàn)均表明，METTL14蛋白是人類催化m6A RNA甲基化的第二個(gè)最活躍的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，與METTL3高度同源，但METTL14沒有甲基轉(zhuǎn)移酶活性。在通過氫鍵與METTL3相互作用形成非常穩(wěn)定的二聚體之前，METTL14在結(jié)合RNA底物方面發(fā)揮了重要作用。擬南芥中已經(jīng)鑒定出MTB（METTL14人類同源蛋白），但其功能仍未知。

Pre-mRNA剪接調(diào)節(jié)因子WTAP的缺失也可能導(dǎo)致mRNA整體m6A水平顯著降低，這表明WTAP是甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的第三個(gè)主要蛋白。WTAP在啟動(dòng)和控制METTL3-METTL14復(fù)合體活性所需的pre-mRNA剪接因子，在細(xì)胞核內(nèi)定位方面起著至關(guān)重要的作用。FIP37（WTAP人同源蛋白）是一種E3泛素連接酶，在擬南芥中首次被鑒定與MTA相互作用。

m6A甲基化復(fù)合物的第四個(gè)關(guān)鍵蛋白KIAA1429是通過敲除突變鑒定出來的，這個(gè)蛋白缺失會(huì)導(dǎo)致哺乳動(dòng)物mRNA整體m6A水平顯著降低。Virilizer是果蠅體內(nèi)的同源蛋白，通過調(diào)控整體m6A水平控制性別分化（sex determination），被認(rèn)為是m6A甲基化復(fù)合物的第五個(gè)蛋白。在擬南芥中，Virilizer（KIAA1429人類同源蛋白）和E3泛素連接酶HAKAI（HAKAI人類同源蛋白）分別被發(fā)現(xiàn)是甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的第四個(gè)和第五個(gè)關(guān)鍵蛋白。

m6A的writers高度保守，因此擬南芥中的蛋白可以提供鑒定不同植物種的同源基因所需的序列信息。大量的植物基因組信息已公開，可以選擇了一些具有代表性的物種進(jìn)行比較基因組分析，包括6個(gè)雙子葉植物物種、6個(gè)單子葉植物物種、1個(gè)蕨類植物物種、2個(gè)苔蘚物種和7個(gè)藻類物種。這些物種的蛋白質(zhì)序列來自Ensembl plants和NCBI。

以擬南芥MTA、MTB、FIP37、Virilizer和HAKAI蛋白序列作為參考序列，用這些下載的蛋白質(zhì)序列構(gòu)建本地蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，然后搜索候選m6A writers。

從Pfam數(shù)據(jù)庫下載MTA70超家族（PF05063）、WTAP超家族（PF17098）和Virilizer motif（PF15912）序列的HMM（隱馬爾可夫模型）信息，并使用HMMER搜索工具評(píng)估所有植物種蛋白質(zhì)序列。159個(gè)候選的m6A writers組件使用HMM搜索和BLASTP進(jìn)行識(shí)別。所有植物共鑒定出69種MTA、MTB和MTC蛋白。

MTA蛋白主要分布在分裂組織中，特別是在生殖器官、頂端分生組織和新生根系組織中。MTA蛋白的失活會(huì)影響發(fā)育，影響植物胚胎在球形階段的發(fā)育，最終導(dǎo)致胚胎死亡。m6A修飾降低與生殖器官、莖和側(cè)根分生組織中MTA蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度降低呈正相關(guān)。

有趣的是，在大麥和小膿皰菌中只發(fā)現(xiàn)了一種MTA。在這兩個(gè)物種中，MTB和MTC蛋白可能采用了MTA蛋白特殊的分子作用。關(guān)于MTC蛋白的功能目前報(bào)道不多，這是本文中確定的另一個(gè)全新的m6A writer。

在玉米和小麥中分別鑒定出5個(gè)FIP37蛋白和2個(gè)FIP37蛋白。FIP37基因敲除后，胚乳和胚胎發(fā)育延遲，隨后導(dǎo)致胚胎致死。FIP37的缺失顯著降低了3′UTR中m6A的修飾，終止密碼子對(duì)5′UTR中m6A的修飾影響較小。

在動(dòng)物中，F(xiàn)IP37的功能與WTAP不同。WTAP定位于細(xì)胞核并影響mRNA的剪接，而FIP則在核漿內(nèi)均勻分布，未發(fā)現(xiàn)影響RNA剪接。FIP37的分布與MTA相似，這兩種蛋白在頂端分生組織、幼葉和花器官中高表達(dá)。FIP37敲除后，植株在莖尖分生組織中表現(xiàn)出細(xì)胞過度增殖，這表明m6A修飾對(duì)于調(diào)節(jié)分生組織中的細(xì)胞分裂至關(guān)重要。

因此，我們推測(cè)這些FIP37對(duì)于維持植物莖分生組織的增殖起著不可或缺的作用（案例解析：擬南芥m6A甲基化酶FIP37調(diào)控莖尖分生組織發(fā)育 | m6A專題）。

m6A E rasers

在哺乳動(dòng)物中，首次發(fā)現(xiàn)m6A去甲基酶——FTO（fat mass and obesity‐associated protein）。FTO以α-酮戊二酸和二價(jià)鐵離子Fe2+依賴方式催化m6A修飾的腺苷轉(zhuǎn)化為不帶m6A修飾的腺苷，這表明m6A是一種可逆的動(dòng)態(tài)修飾。然而，最近的研究報(bào)告稱FTO是m6Am,去甲基化酶，而不是m6A本身。部分研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)孜餅閙6Am時(shí)，F(xiàn)TO的催化率明顯高于m6A。此外，Jaffrey等人也發(fā)表論文稱FTO在consensus site分析中顯示出對(duì)m6Am的強(qiáng)烈偏好，而對(duì)m6A沒有偏好。

第二種m6A去甲基化酶是ALKBH5（alkylation repair homolog 5, 烷基化修復(fù)同系物5）是FTO一樣都是Alkb家族的同源蛋白。乳腺癌細(xì)胞中ALKBH5蛋白的表達(dá)升高與m6A整體水平的降低有直接關(guān)系。當(dāng)?shù)孜餅閙6A修飾的RNA時(shí)候時(shí)，ALKBH5具有催化活性使腺嘌呤上的m6A修飾被去除，但是ALKBH5對(duì)未發(fā)生m6A修飾的腺嘌呤本身沒有催化活性，這表明ALKBH5是一種m6A去甲基酶。

何川課題組在2014年Nature Communications的文章中對(duì)擬南芥進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和m6A-seq。結(jié)果表明，m6A修飾在擬南芥中是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程（案例解析：m6A-seq揭示擬南芥RNA甲基化獨(dú)特特性 | m6A專題）。

其他幾項(xiàng)研究均證實(shí)，帶m6A修飾的腺嘌呤可通過去甲基化酶ALKBH9b和ALKBH10b的作用下還原為不帶有m6A修飾的腺苷（案例解析：擬南芥去甲基化酶ALKBH10調(diào)控成花轉(zhuǎn)變 | m6A專題）。ALKBH9b定位于在有siRNA的胞質(zhì)顆粒，可定向到P小體。ALKBH9b和ALKBH10b屬于鐵II/α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶（Fe(II)/α‐ketoglutarate‐dependent dioxygenases）的Alkb家族蛋白，包含高度保守的synthase‐like合成酶結(jié)構(gòu)域。下載了synthase‐like合成酶結(jié)構(gòu)域（PF13532）序列的HMM信息，并使用HMMER搜索工具識(shí)別了22個(gè)植物物種的同源基因。共鑒定出22種植物中大腸桿菌alkb家族293個(gè)同源物。

這些研究揭示了擬南芥m6A去甲基化的過程由ALKBH9b和ALKBH10b介導(dǎo)，盡管去甲基酶家族在其他植物物種中的存在和作用機(jī)制尚不清楚。

m6A readers

為了了解m6A相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，m6A閱讀蛋白的功能至關(guān)重要。這些閱讀蛋白與m6A修飾的RNA能夠特異結(jié)合，實(shí)現(xiàn)甲基化修飾的生物學(xué)功能。

需要注意的是，m6A閱讀蛋白不參與腺嘌呤上N6的甲基化和去甲基化的作用，而是與m6A的RNA結(jié)合后進(jìn)一步發(fā)揮功能。

YTHDF2和YTHDF3是由Gideon Rechavi課題組在2012那篇Nature中首次報(bào)道。這2個(gè)m6A閱讀蛋白是Gideon Rechavi的學(xué)生Dan Dominissini采用Pull-down的形式鑒定到的。

YTH家族成員高度保守，包含一個(gè)芳香口袋的YTH結(jié)構(gòu)域，用于識(shí)別m6A修飾的堿基。這些蛋白質(zhì)廣泛存在于人類、果蠅、酵母和擬南芥中。

此外，不同的m6A閱讀蛋白可以產(chǎn)生不同的功能。例如，YTHDF1通常定位于胞漿/細(xì)胞質(zhì)中，但也很有可能與細(xì)胞核中的eIF3相作以促進(jìn)翻譯起始和蛋白質(zhì)合成。

胞漿中YTHDF2蛋白上有鑒定到超過3000個(gè)含有m6A的靶RNA，在大多數(shù)的mRNA和一些非編碼RNAs中，它能特異地識(shí)別m6A的保守核心基序GAC。

有趣的是，YTHDF1和YTHDF2這兩個(gè)蛋白的靶mRNAs存在大量交叉重疊現(xiàn)象。YTHDF1促進(jìn)靶mRNAs的有效翻譯，而YTHDF2能夠識(shí)別這些靶mRNA并促進(jìn)其降解。

此外，m6A結(jié)合蛋白YTHDC1位于細(xì)胞核中，并介導(dǎo)了mRNA剪接。YTHDC1與pre-mRNA剪接因子SRSF3互作，促進(jìn)其與帶有m6A堿基修飾的RNA結(jié)合，抑制剪接因子SRSF10與m6A之間的結(jié)合，導(dǎo)致m6A修飾發(fā)生可逆。

LncRNA XIST可通過招募結(jié)合甲基酶復(fù)合物所需的蛋白R(shí)MB15和RBM15b，在XIST上誘導(dǎo)m6A甲基化。YTHDC1與m6A位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)X染色體基因中XIST介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默。

在本文中，通過BLASTP和HMMER搜索（PF04146），共鑒定了22個(gè)植物中的278個(gè)m6A閱讀蛋白?；谛蛄邢嗨菩裕琘TH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可分為兩個(gè)不同的亞家族：YTHDF和YTHDC。

YTHDF亞家族蛋白主要結(jié)合mRNA中的所有m6A位點(diǎn)，而YTHDC僅結(jié)合mRNAs和非編碼RNAs中的某些核富集位點(diǎn)。在這項(xiàng)研究中，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示55個(gè)YTH蛋白可分為YTHDC亞家族，223個(gè)可分為YTHDF亞家族。

綜上所述，這些甲基化轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和甲基化閱讀蛋白的識(shí)別、分類和特征將有助于建立屬于植物生物學(xué)中獨(dú)有的m6A調(diào)控途徑。

植物中m6A的功能描述與簡(jiǎn)介

m6A與mRNA加工

由于擬南芥擁有比較完整的突變體庫，所以在研究m6A的模式植物上絕對(duì)是不二之選。

關(guān)于植物中m6A修飾或m6A相關(guān)酶的機(jī)制與功能研究仍然數(shù)量較少。首先，m6A被認(rèn)為是最重要的RNA修飾之一，無論是mRNA降解、穩(wěn)定性、翻譯還是小RNA加工都與m6A修飾相關(guān)。

3′ UTR和5′ UTR區(qū)域的m6A修飾都與基因表達(dá)呈正相關(guān)，而mRNA其他區(qū)域的m6A修飾會(huì)導(dǎo)致擬南芥的基因表達(dá)降低（案例解析：m6A-seq揭示擬南芥RNA甲基化獨(dú)特特性 | m6A專題）。

ECT2蛋白作為YTHDF2人同源蛋白，不僅調(diào)控核內(nèi)的3′UTR加工，還通過結(jié)合帶有m6A修飾的堿基，在促進(jìn)mRNA穩(wěn)定和控制胞質(zhì)內(nèi)的mRNA命運(yùn)中起著關(guān)鍵作用（案例解析：m6A-YTH組件調(diào)控?cái)M南芥葉片發(fā)育時(shí)間和形態(tài)發(fā)生 | m6A專題）。

最近的研究發(fā)現(xiàn)5′ UTR的m6A修飾可以影響蛋白質(zhì)的翻譯效率。第一個(gè)證據(jù)來自熱休克應(yīng)激反應(yīng)的研究，從而導(dǎo)致m6A修飾的重新分布，使得5′ UTR區(qū)域內(nèi)的m6A修飾比例增加，并在應(yīng)激條件下促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯。

在METTL3的突變體中，在mRNA 5′ UTR中含有m6A修飾會(huì)降低翻譯效率，但在終止密碼子或3′ UTR區(qū)域卻沒有類似現(xiàn)象，這表明5′ UTR上的m6A修飾會(huì)影響細(xì)胞的翻譯效率。

此外，m6A修飾在mRNA上不同部位也能對(duì)翻譯機(jī)調(diào)控制產(chǎn)生明顯的影響。例如，eIF4E是翻譯啟動(dòng)的關(guān)鍵蛋白。mRNA上3′ UTR有m6A可以招募閱讀蛋白YTHDF1，通過與eIF4E/eIF4G/eIF3之間建立聯(lián)系，將43s啟動(dòng)前復(fù)合體招募到5′cap，從而促進(jìn)依賴cap的翻譯。

然而，應(yīng)激反應(yīng)基因中的5′ UTR m6A修飾通過直接結(jié)合eIF3和隨后招募非eIF4E依賴的43s核糖體復(fù)合物來獨(dú)立促進(jìn)翻譯。

此外，在擬南芥中m6A去甲基化酶ALKBH9b還介導(dǎo)了mRNA沉默和衰變的過程。

m6A在植物發(fā)育中的作用

m6A修飾被認(rèn)為在植物胚胎發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶在胚胎后表達(dá)水平降低，包括MTA、MTB、FIP37、Virilizer和HAKAI，導(dǎo)致m6A整體水平顯著減少。這些m6A writers的表達(dá)降低或敲除產(chǎn)生了不同的分化表型，包括毛狀枝、缺陷葉萌生、營養(yǎng)枝頂端分生組織過度增殖，最終導(dǎo)致胚胎致死。

ECT2的敲除增加了毛狀體分支，表明ECT2對(duì)調(diào)節(jié)毛狀體分支的發(fā)育至關(guān)重要。ALKBH10b的敲除導(dǎo)致開花延遲，也抑制了營養(yǎng)生長，表明ALKBH10b介導(dǎo)的mRNA去甲基化修飾影響mRNA轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性繼而影響成花轉(zhuǎn)變。

某些m6A相關(guān)基因在調(diào)控愈傷組織中轉(zhuǎn)錄因子活性方面起著不可或缺的作用，而其他m6A相關(guān)基因則與葉綠體以及類囊體功能相關(guān)。

此外，N6‐mAMP脫氨酶（MAPDA）將N6‐mAMP分解為IMP，這可能與根系發(fā)育有關(guān)，因?yàn)镸APDA的敲除會(huì)導(dǎo)致根系生長速度略有下降。

m6A在脅迫刺激下應(yīng)激反應(yīng)

越來越多的研究表明m6A也參與調(diào)節(jié)對(duì)各種非生物（abiotic）和生物脅迫（biotic stress）的反應(yīng)。不同的細(xì)胞應(yīng)反應(yīng)可導(dǎo)致m6A在轉(zhuǎn)錄層面重新分布，導(dǎo)致m6A與5′UTR區(qū)域整體m6A水平的增加。

5′ UTR上的m6A修飾以一種不依賴帽子結(jié)構(gòu)的方式來指導(dǎo)eIF3E的結(jié)合，以促進(jìn)哺乳動(dòng)物mRNA在熱應(yīng)激下的翻譯啟動(dòng)機(jī)制。

m6A整個(gè)調(diào)控及修飾模式是動(dòng)態(tài)的，約5-30%的m6A peak在紫外線、熱休克或干擾素γ作用下發(fā)生改變，從而影響基因表達(dá)和剪接。

在植物中，許多研究揭示了m6A對(duì)應(yīng)激反應(yīng)的動(dòng)態(tài)分子調(diào)控機(jī)制。ECT1和ECT2與應(yīng)激反應(yīng)蛋白CIPK1（Calcineurin B‐Like‐Interacting Protein Kinase1）能夠特異性互作，并在不同外部條件刺激下，將鈣信號(hào)傳遞到細(xì)胞核中。

盡管ECT2缺乏YTH結(jié)構(gòu)域，但在細(xì)胞質(zhì)中ECT2能與在3’ UTR含有m6A修飾的mRNA相互結(jié)合。這一由ECT2介導(dǎo)的對(duì)植物特異性m6A motif的識(shí)別，允許它在熱應(yīng)激條件下下將mRNA重新定位到應(yīng)激顆粒（案例解析：m6A-YTH組件調(diào)控?cái)M南芥葉片發(fā)育時(shí)間和形態(tài)發(fā)生 | m6A專題）。

其他研究還證實(shí)，在病原微生物的脅迫下，植物的m6A整體水平出現(xiàn)上升。西班牙某研究團(tuán)隊(duì)在PNAS曾經(jīng)發(fā)文稱，擬南芥去甲基化酶ALKBH9b降低了RNA整體的m6A水平，并可能通過與病毒外殼蛋白（coat protein）的相互作用，共同影響AMV（苜?；ㄈ~病毒）的侵染能力。ALKBH9b發(fā)生突變后，擬南芥體內(nèi)病毒RNA整體m6A水平上升（病毒m6A專題 | 擬南芥去甲基化酶調(diào)控病毒上m6A修飾）。

中科院北京基因組研究所于軍教授團(tuán)隊(duì)，曾經(jīng)在2014年分別對(duì)水稻分化愈傷組織和葉片進(jìn)行了m6A-seq和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)果表明基因上發(fā)生m6A位點(diǎn)在正常水稻組織以及人和小鼠之間高度保守。

然而，一些m6A修飾位點(diǎn)在mRNA的區(qū)域也可能表現(xiàn)出物種特異性、細(xì)胞特異性或應(yīng)激特異性調(diào)節(jié)。例如，與葉片相比，水稻愈傷組織中發(fā)生m6A修飾的基因及發(fā)生修飾的mRNA上的具體區(qū)間（如TSS、TES、3’ UTR及5’ UTR等）具有組織特異性。

擬南芥葉綠體和線粒體中帶有堿基修飾的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中m6A修飾占到了84%的比例，換句話說大部分堿基修飾都是m6A修飾。

另外64%和79%的m6A甲基化轉(zhuǎn)錄物在葉、花和根之間不同的組織表達(dá)方式有所不同。為了了解具體不同基因在不同位點(diǎn)特異性m6A修飾在mRNAs中發(fā)揮的功能，有必要更深入研究不同物種、細(xì)胞和外界壓力下m6A修飾究竟有何差別。

如此看來m6A修飾似乎是控制基因表達(dá)、植物發(fā)育和生理過程的有效植物調(diào)控策略。

m6A甲基化酶在植物中的進(jìn)化

為了了解m6A三種甲基化酶的進(jìn)化歷史和相互關(guān)系，文章分析了22個(gè)代表性植物中m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶。結(jié)果表明，在高等植物中，m6A writers的數(shù)量比低等植物中要多，這表明高等植物可能需要更精確的m6A修飾調(diào)控機(jī)制，以應(yīng)對(duì)復(fù)雜多變的環(huán)境。

值得注意的是，m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶在外果皮中沒有被鑒定出來。除變種的小球藻和萊茵衣藻外，蕨類植物物種和藻類物種均不含病毒和HAKAI相關(guān)蛋白。

萊茵衣藻是一種單細(xì)胞綠藻，屬于陸生植物分化前較早的一種原始生物。因此這些結(jié)果可能表明，在這些植物物種中，VIRILIZER和HAKAI并不存在。所以我們推測(cè)，蕨類植物和大多數(shù)藻類可能有一個(gè)m6A修飾的替代機(jī)制或另一個(gè)至今仍未被鑒定的蛋白在行使m6A修飾的作用，而不僅僅是只有上面兩個(gè)提到的m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶。

然而，目前有關(guān)這一領(lǐng)域的文獻(xiàn)資料較少，希望今后有更多的課題組對(duì)低等植物m6A修飾機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。

有趣的是，異源六倍體小麥中擁有數(shù)量最為龐大的m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶。目前，對(duì)植物m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶的研究還比較少。大多數(shù)仍然集中在人、小鼠、果蠅、酵母等模式生物中。

按照目前研究來看，僅有擬南芥目前有少量的m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶報(bào)道。如若對(duì)植物中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物開展鑒定，將有助于理解植物中m6A修飾發(fā)揮的巨大功能。

為了研究m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶在保守的核心結(jié)構(gòu)域上的進(jìn)化關(guān)系，我們預(yù)測(cè)MTA、MTB、FIP37和Virilizer中的保守蛋白結(jié)構(gòu)域。

這22個(gè)植物中最主要的四種甲基化轉(zhuǎn)移酶，能夠識(shí)別出的保守結(jié)構(gòu)域一些細(xì)節(jié)如上圖所示。大多數(shù)MTA成員具有一個(gè)SAM（S-腺苷甲硫氨酸）甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合域，除藜麥外在所有研究物種中都高度保守。

此外，所有物種中的MTB蛋白也包含一個(gè)SAM甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合域或SAM結(jié)合位點(diǎn)MTA70，這是具有甲基化催化活性的結(jié)構(gòu)域。

所有FIP37蛋白都包含一個(gè)WTAP結(jié)構(gòu)域，而Virilizer蛋白在所有物種中都包含一個(gè)Virilizer motif。結(jié)果表明所有植物中，m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶一些關(guān)鍵區(qū)域的蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)域都高度保守。

被子植物中ALKBH家族蛋白數(shù)量最多，其次是蕨類植物，最后是苔蘚植物。

藻類中ALKBH家族蛋白整體被鑒定到的數(shù)量與其他植物相比特別低，但艾米莉亞綱植物除外。

在小麥和藜麥中分別鑒定出29和27種ALKBH家族蛋白。所研究物種之間的主要區(qū)別在于陸地植物的基因組含有大量的ALKBH蛋白，而藻類可能只有一個(gè)拷貝。

在植物從低單細(xì)胞生物向高花植物進(jìn)化的過程中，進(jìn)一步探索ALKBH蛋白的種類是如何擴(kuò)展的，這將是非常重要的。

所有植物ALKBH家族成員彼此高度相似，并具有clavaminate synthase‐like合成酶結(jié)構(gòu)域。

值得注意的是，髕骨酸漿菌有一個(gè)鋅指基序，而番茄有一個(gè)富含亮氨酸拉鏈的結(jié)構(gòu)域，這表明它們也可能作為轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。

m6A在進(jìn)化過程中可能保留某些保守功能。這種原始形態(tài)的蛋白通常具有類似的生物學(xué)功能，廣泛分布于不同物種。

系統(tǒng)發(fā)育分析是一種快速和相對(duì)準(zhǔn)確的鑒別同源蛋白質(zhì)的方法。利用MEGA6采用NJ法基于序列相似性構(gòu)建ALKBH蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹。如果蛋白具有類似m6A去甲基化的功能，則被認(rèn)為是擬南芥ALKBH9b和ALKBH10b同源蛋白。

在水稻（Oryza indica）中鑒定出12種ALKBH蛋白質(zhì)，其中，ALKBH5b、ALKBH6b和ALKBH12b被歸類為潛在的m6A去甲基化酶。

此外，在小麥中鑒定出29種ALKBH蛋白，其中ALKBH4b、ALKBH6b和ALKBH29b被歸類為m6A去甲基化酶。目前，雖然我們發(fā)現(xiàn)OsALKBH1可能與去甲基化酶很接近，但在水稻中至今仍然沒有發(fā)現(xiàn)m6A去甲基化酶。

有人假設(shè)，作為Alkb的同源蛋白，EGL‐9可能參與植物RNA病毒中的RNA去甲基化修飾這一過程。這項(xiàng)研究的結(jié)果可能對(duì)試圖理解植物中m6A調(diào)節(jié)機(jī)制有一些幫助。

植物比其他真核生物（包括酵母、人及其他哺乳動(dòng)物）含有更多的YTH結(jié)構(gòu)域蛋白。例如，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了13種含有YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白——ECT1-12和CPSF30。擬南芥中，這些蛋白數(shù)量明顯高于哺乳動(dòng)物中已經(jīng)確定的5種蛋白（YTHDF1-3、YTHDC1-2）。

結(jié)果表明，YTH蛋白在植物中廣泛存在。被子植物中的YTH蛋白的數(shù)量特別高，尤其在小麥、藜麥和陸地棉中分別發(fā)現(xiàn)了41、30和29種YTH蛋白。

在蕨類植物、苔蘚植物和藻類中發(fā)現(xiàn)的YTH蛋白數(shù)量較少，其生物學(xué)重要性仍然未知。值得注意的是，分裂酵母中的YTH結(jié)構(gòu)域蛋白MMI1不與m6A的腺嘌呤相互結(jié)合，但可以識(shí)別特定的核苷酸序列，這表明并非所有的YTH結(jié)構(gòu)域都與m6A修飾的堿基結(jié)合有關(guān)。

CPS30是植物多聚腺苷酸化復(fù)合物的成員之一，它屬于擬南芥中的YTHDC蛋白家族下的一個(gè)亞型。所有植物中，YTHDC亞家族蛋白都含有YTH結(jié)構(gòu)域或高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)。

在所研究的5種藻類（藍(lán)藻、埃米利亞、團(tuán)藻、外果皮和衣藻）中均未發(fā)現(xiàn)YTHDC蛋白，表明大多數(shù)藻類在進(jìn)化過程中沒有發(fā)生YTHDC基因的復(fù)制事件。

值得注意的是，兩種單子葉植物高粱和普通大麥也缺乏YTHDC蛋白，而所有雙子葉植物、蕨類植物和苔蘚植物物種都有一個(gè)或多個(gè)YTHDC家族蛋白成員。我們推測(cè)，在不同單子葉植物的進(jìn)化過程中，這種YTHDC蛋白亞型可能已經(jīng)消失。

一些研究表明，YTHDC1是調(diào)節(jié)內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄物可變剪切的關(guān)鍵蛋白之一。最重要的是，只有YTHDC1才能與XIST基因上的76個(gè)m6A修飾位點(diǎn)相互結(jié)合，這對(duì)抑制female cells中的基因起著十分關(guān)鍵的作用。YTHDC1將介導(dǎo)XIST功能性抑制X染色體上的基因表達(dá)。另一種閱讀器蛋白YTHDC2則通過其解螺旋酶功能提高了HIF1α mRNA的翻譯效率。

一個(gè)主要的功能YTH域從所有植物種的YTHDF亞科成員中被鑒定了出來。是高度保守，主要定位在細(xì)胞質(zhì)。

小麥中的YTH結(jié)構(gòu)域位于蛋白N末端，這表明ECT5可能結(jié)合來自可翻譯的帶有m6A修飾的mRNA并轉(zhuǎn)移到加工體。相反，卷柏和水稻中的YTH結(jié)構(gòu)域位于蛋白C端，這表明ECT2和ECT1選擇性結(jié)合帶m6A修飾的mRNA。

所有物種都含有至少一個(gè)YTHDF亞科蛋白，表明植物的共同祖先可能經(jīng)歷了相似的基因復(fù)制，這些復(fù)制的產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)化出新的特征。

在擬南芥中，ECT2、ECT3和ECT4被確認(rèn)為m6A閱讀擔(dān)保，并且能夠識(shí)別帶有m6A修飾的堿基及mRNA。

與YTH結(jié)構(gòu)域相關(guān)的另一種蛋白質(zhì)是擬南芥中的CPSF30。CPSF30定位于細(xì)胞核，通過調(diào)節(jié)參與擬南芥水楊酸途徑的3′端mRNA的剪接，對(duì)外部刺激作出反應(yīng)，并發(fā)揮重要作用。

通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，已在21個(gè)其他物種中鑒定出擬南芥ECT2/3/4和CPSF30的同源蛋白。在小麥中鑒定出了YTH蛋白共41個(gè)，只有8種蛋白被發(fā)現(xiàn)是潛在的m6A閱讀蛋白。

在水稻中鑒定出14種YTH蛋白，其中3種蛋白被發(fā)現(xiàn)是潛在的m6A閱讀蛋白。

上述從小麥和水稻中鑒定到的蛋白，被認(rèn)為具有與擬南芥相似的功能，但目前尚不清楚這些蛋白是否真的作為植物中的m6A閱讀蛋白。

綜上所述，m6A甲基化酶自植物早期進(jìn)化以來，就存在于許多植物共同祖先的遺傳信息中，與這些蛋白相關(guān)的結(jié)構(gòu)域在藻類、蕨類植物和被子植物中都高度保守。但是某些蛋白似乎在進(jìn)化過程中丟失了。進(jìn)一步深入了解低、高等植物之間m6A甲基化酶的進(jìn)化關(guān)系，可以能更好地了解它們的功能。

結(jié)論及未來的展望

在本文中，我們系統(tǒng)地回顧了植物m6A甲基化酶的蛋白結(jié)構(gòu)、組成、功能和進(jìn)化。對(duì)這些m6A相關(guān)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較研究后，將有助于理解m6A修飾的動(dòng)態(tài)過程及其功能作用，并加深我們對(duì)m6A如何在植物中發(fā)揮RNA表觀遺傳調(diào)控的理解。

近幾年來，為了檢測(cè)RNA上的m6A修飾，國內(nèi)外許多課題組開發(fā)了一系列高效的高通量檢測(cè)工具。m6A-seq也叫MeRIP-seq，采用特異性較強(qiáng)的m6A抗體，與帶有m6A修飾的RNA片段結(jié)合進(jìn)行高通量測(cè)序，是RIP-seq的一種特殊形式。

此外，miCLIP-seq可以做到幾乎單堿基分辨率，而m6A-seq只能做到對(duì)某個(gè)高甲基化區(qū)域進(jìn)行分析。另外還包括JACS上發(fā)表的低通量m6A單堿基分辨率檢測(cè)方法，以及最新駱觀正課題組發(fā)明的非抗體依賴的ACA內(nèi)切酶法，都在m6A檢測(cè)的精度和深度上有了質(zhì)的飛越。

在數(shù)據(jù)庫上，中山大學(xué)的任間教授和屈良鵠教授分別構(gòu)建了比較完整的m6A數(shù)據(jù)庫。

另外中科院細(xì)胞生化所的陳玲玲教授和楊力教授在circRNA m6A修飾的研究上有了新突破，還開發(fā)了一系列新的算法來檢測(cè)circRNA上m6A修飾情況。

盡管m6A研究已經(jīng)取得了不少突破，但仍需要進(jìn)一步的工作來全面了解m6A的功能。

首先，應(yīng)該在植物中全面挖掘m6A的writers、erasers和readers的“真實(shí)身份”，這將有助于理解植物物種中多種類型RNA分子的甲基化水平是如何調(diào)節(jié)的。

其次，應(yīng)該仔細(xì)驗(yàn)證m6A甲基化酶的表達(dá)模式，因?yàn)閬碜酝换蚣易宓牟煌膍6A甲基化酶，會(huì)產(chǎn)生不同的mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)或翻譯機(jī)制。

第三，雖然對(duì)m6A在植物中的作用和分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)逐漸增加，但大多數(shù)的研究都集中在模式植物擬南芥中，而對(duì)其他重要的經(jīng)濟(jì)作物糧食作物的研究卻很少。目前尚不清楚m6A修飾是如何調(diào)節(jié)器官形成、細(xì)胞分裂、生長發(fā)育，特別是小麥、大麥和水稻等世界主要作物。今后對(duì)作物RNA上的m6A進(jìn)行深入研究，可以進(jìn)一步提高作物種子產(chǎn)量，并且可能還能為作物抗逆境脅迫能力的提高提供有參考價(jià)值的信息。