title: 文獻(xiàn)筆記-Where, When, and How Context-Dependent Functions of RNA Methylation Writers, Readers, and Erasersinfection
date: 2019-11-22 12:00:00
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• 文獻(xiàn)筆記

注：以前看綜述的時候，我喜歡把原文逐字翻譯為漢語，效率比較低，現(xiàn)在我就采用筆記的形式的來看綜述，按照原文的結(jié)構(gòu)，把關(guān)鍵點記錄下來，再加上自己的理解即可。

文獻(xiàn)信息

Hailing Shi, Jiangbo Wei, Chuan He,Where, When, and How: Context-Dependent Functions of RNA Methylation Writers, Readers, and Erasers,Molecular Cell,Volume 74, Issue 4,2019,Pages 640-650,
ISSN 1097-2765,https:///10.1016/j.molcel.2019.04.025.

摘要

細(xì)胞RNA會天然地經(jīng)歷各種化學(xué)修飾。這些經(jīng)化學(xué)修飾的核苷酸又賦予了其自身結(jié)構(gòu)的多樣性，從而在各種有序的代謝與機體的功能方面發(fā)揮著各種調(diào)控功能，進而影響了基因的表達(dá)。隨著對回貼(mapping)位點修飾的全轉(zhuǎn)錄組測序方法的發(fā)展，對精確修飾進行檢測和定量的高靈敏質(zhì)譜方法的進步，以及參與修飾的“效應(yīng)器”(effectors，包括各種能改變各種修飾位點的酶，例如寫入器(writers)和擦除器(erasers)和能識別化學(xué)修飾位點的讀取器(readers)）理解的加深，最近幾年有關(guān)RNA修飾的研究呈現(xiàn)暴發(fā)式地增長。然而由于RNA種類龐雜，表達(dá)水平有差異，因此這給RNA修飾的研究帶來了很大的挑戰(zhàn)，另外，RNA的修飾還與細(xì)胞類型，組織特異性，以及修飾效應(yīng)器的定位有關(guān)，這又增加了研究難度。我們在這篇綜述里，重點闡述了最近幾年關(guān)于-甲基化轉(zhuǎn)換酶(m6A, )功能的研究進展，強調(diào)了環(huán)境(context)對RNA修飾調(diào)控和功能的重要性。

前言

早期研究發(fā)現(xiàn)，m6A主要發(fā)生在(G/A)(m6A)C序列上。最近的研究發(fā)現(xiàn)，m6A主偏向于出現(xiàn)在終止密碼子和3'UTR上，因此我們可以推斷，m6A可以影響基因的表達(dá)。
m6A途徑的效應(yīng)器(effectors)包括寫入器(writers)，擦除器(erasers)和讀取器(readers)，其中寫入器往核苷酸上添加上甲基，擦除器反之，即去掉核苷酸上的甲基，讀取器則是能夠識別那些核苷酸上含有甲基的序列，它們的成員如下圖的Figure 1所示：

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m6A甲基化的寫入器

m6A是通過一個復(fù)合物加到mRNA上的（Figure1），這個復(fù)合物有多個亞基，包括METTL3，METTL14，WTAP，VIRMA，ZC3H13，HAKAI，RBM15/15B。其中包括以下成員：

• METTL3/14，全稱是methyltransferase-like 3/14，即甲基轉(zhuǎn)移酶3/14， 這兩個甲基轉(zhuǎn)移酶是這個復(fù)合物的核心成員，其中MELLT3起催化作用，MELLT14促進復(fù)合物與RNA結(jié)合。
• WTAP，全稱是Wilms tumor 1-associating protein，其功能是結(jié)合METTL3/14，誘導(dǎo)它們向底物招募以及定位。
• VIRMA，全稱是Vir like m6A methyltransferase associated，功能是將m6A與3'UTR結(jié)合。
• ZC3H13，全稱是zinc ?nger CCCH-type containing 13，功能是誘導(dǎo)寫入器復(fù)合物向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。
• RBM15/15B全稱是RNA binding motif protein 15/15B，功能是與尿嘧啶富集區(qū)域結(jié)合，促進某些RNAs的甲基化。

METTL3的功能

METTL3在各類細(xì)胞中的分布不同，例如在HeLa細(xì)胞中，METTL3/METTL14會形成二聚體結(jié)構(gòu)與WTAP產(chǎn)生相互作用，然后進入細(xì)胞核形成斑點(speckle)。METTL3和WTAP中含有NLS(nuclear localization signals)，NLS的突變會導(dǎo)致復(fù)合物無法入核。METTL3還存在于一些細(xì)胞質(zhì)中，例如在一些癌細(xì)胞系，包括HeLa，MDA-MB-231，MOLM13細(xì)胞系等。還有一些情況，例如在小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中，METTL14位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核?，F(xiàn)在還不清楚為什么METTL3的定位為什么會出現(xiàn)如此差異。METTL3/METTL14的比例在不同的細(xì)胞系中也有差異，這可能會影響METTL3的定位。
寫入器的招募導(dǎo)致了轉(zhuǎn)錄本上的m6A的特異性，這一招募過程可能是由TF或表觀遺傳標(biāo)記介導(dǎo)的，如下下圖的Figure 2所示：

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METTL3在細(xì)胞核中的作用

當(dāng)出現(xiàn)熱休克時，METTL3就會定位到染色質(zhì)的熱休克相關(guān)的基因上，m6A就會被添加到熱休克轉(zhuǎn)錄本上，從而誘導(dǎo)這些轉(zhuǎn)錄本在應(yīng)激壓力下被清除。UV誘導(dǎo)DNA破壞時，METTL3/14就會在2分鐘內(nèi)定位到UV誘導(dǎo)的損傷位點，同時伴隨著m6A活動的增強。在人類多能干細(xì)胞的TGF-信號轉(zhuǎn)錄通路轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，活化的SMAD2/3會與METTL3/14-WTAP相互作用，誘導(dǎo)m6A添加到特定的轉(zhuǎn)錄本上。在AML細(xì)胞中，一部分METTL3會通過METTL14非依賴方式與CCAAT增強子結(jié)合蛋白zeta(CEBPZ)的啟動子區(qū)域結(jié)合。在HepG2細(xì)胞中，H3K36me3能通過與METTL14相互作用招募寫入器，誘導(dǎo)mRNA的CDS和3'UTR上添加m6A。

METTL3在細(xì)胞質(zhì)中的促進翻譯作用

METTL3還能作為一個潛在的m6A讀取器，在Figure 2B中，我們可以看到，在肺癌細(xì)胞中，METTL3此時并沒有發(fā)揮催化作用，而是在細(xì)胞質(zhì)中錨定到了3'UTR上，促進了一個報告mRNA的翻譯。進一步的研究表明，METTL3是通過eIF3h相互作用來促進翻譯的。
METTL3蛋白自身會通過PTM或與其它蛋白質(zhì)相互作用來發(fā)揮調(diào)控功能，例如人類的METTL14能夠誘導(dǎo)METTL3的絲氨酸399磷酸化。人類的METTL3會出現(xiàn)SUMOylation修飾，導(dǎo)致METTL3/14的活性降低。但這些現(xiàn)象的機制還不清楚。

序列和結(jié)構(gòu)特異性誘導(dǎo)的甲基化

METTL3/14復(fù)合物偏愛RRACH模序(R=A或G；H=A，C或U)，METTL16則偏愛另外的序列與結(jié)構(gòu)。METTL16被驗證的兩個特異性序列是U6(U6 small nuclear RNA, snRNA)和人類MAT2A(methionine adeno-syltransferase 2A)上的一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hp1)，MAT2A編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adeno-sylmethionine synthetase, SAM synthetase)。有實驗分析發(fā)現(xiàn)，METTL16偏愛一個形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)膨大處的UAC(m6A)GAGAA序列。EMTTL16介導(dǎo)的MAT2A甲基化是SAM穩(wěn)態(tài)的負(fù)反饋信號。最近發(fā)現(xiàn)了ZCCH4是一個新的m6A讀取器。

m6A讀取器

m6A讀取器通過作用于含有m6A的mRNA來發(fā)揮作用，F(xiàn)igure 1中可以把讀取器分為三類。

第一類讀取器含有YTH結(jié)構(gòu)域（YTH的全是YT521-B homology），這些成員包括YTHDF1-3(YTH domain family 1-3)，YTHDC1-2(YTH domain containing 1-2)（參考Figure 1）。細(xì)胞質(zhì)中的YTHDF2會通過招募CCR4-NOT腺嘌呤酶復(fù)合物來誘導(dǎo)靶轉(zhuǎn)錄本的部分降解。細(xì)胞質(zhì)中的YTHDF1和YTHDF3能促進HeLa細(xì)胞中靶轉(zhuǎn)錄本的翻譯。細(xì)胞核中的YTHDC1有多個作用，包括招募某些剪接因子調(diào)控mRNA的剪接，促進mRNA的輸出，加速某些轉(zhuǎn)錄本的降解。YTHDC2調(diào)控mRNA的穩(wěn)定，翻譯以及精子形成。

第二類讀取器是HNRNPs，全稱是heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，成員包括HNRNPC，HNRNPG與HNRNPA2B1，它們能調(diào)控靶轉(zhuǎn)錄本的剪接，加工，它們能與RNA的某些結(jié)構(gòu)結(jié)合，這些結(jié)構(gòu)是由m6A介導(dǎo)形成的，因為m6A會重構(gòu)局部的RNA結(jié)構(gòu)，調(diào)控RNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用，這一現(xiàn)象稱為m6A開關(guān)(m6A-switch)。

第三類讀取器含有相同的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD, RNA binding domains)，例如KH結(jié)構(gòu)域(K homology)，RNA識別模序(RNA recognition motif)，以及RGG( arginine/glycine-rich)結(jié)構(gòu)域，它們都能與含有m6A的mRNA結(jié)合，包括FMR1和IGF2BP1-3。FMR1(Fragile X mental retardation 1)含有3個KH結(jié)構(gòu)域，1個RGG結(jié)構(gòu)域，它有可能通過與YTHDF1和YTHDF2相互作用來影響RNA的轉(zhuǎn)移，RNA的穩(wěn)定。IGF2BP1-3(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins 1–3)能通過m6A的方式穩(wěn)定靶轉(zhuǎn)錄本（YTHDF2與之相反，它是降解靶轉(zhuǎn)錄本）。IGF2BP蛋白功能的核心是KH3-4結(jié)構(gòu)域，這是與m6A結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。
Prrc2a是最近發(fā)現(xiàn)的一個讀取器，它與髓鞘形成有關(guān)，具體機制不明。

為什么讀取器會結(jié)合一些m6A位點

以下為作者的幾個猜測。

第一，讀取器有可能與其它的RBP相互作用，從而被招募到mRNA的不同區(qū)域。IGF2BP1-3和YTHDF2通過在不同位點來調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性，例如IGF2BP1-3結(jié)合到3'UTR，而YTHDF2結(jié)合到CDS區(qū)。而RBP對RNA的識別取決于多個因素，例如結(jié)合位點的序列，序列的側(cè)翼以及RNA的二級結(jié)構(gòu)。因此RBP與讀取器蛋白質(zhì)的相互作用有可能涉及了m6A位點的特異性。

第二，m6A位點的密度和序列也可能與之有關(guān)。

第三，讀取器蛋白會在細(xì)胞區(qū)室的特定位點富集，因此會偏向與局部一些RNA類型結(jié)合。例如，YTHDF1-3，F(xiàn)MR1和HNRNPA2B1位于細(xì)胞的應(yīng)激顆粒核心地區(qū)。在乳腺癌細(xì)胞中，YTHDF1-3，HNRNPK和IGF2BP2-3位于細(xì)胞的突起(protrusion)。
甲基化可以促進翻譯或影響某一轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性，這取決于揎細(xì)胞環(huán)境下哪個讀取器占據(jù)主導(dǎo)地位，如Figure 3所示：

讀取器對外界刺激的應(yīng)答

在某些刺激下，例如熱休克應(yīng)激或病毒感染會誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中的YTHDF進入細(xì)胞核。在熱休克出現(xiàn)的幾小時內(nèi)，YTHDF2的轉(zhuǎn)錄本與蛋白水平都上升，并且多數(shù)YTHDF2轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。有人認(rèn)為，YTHDF2核心的YTHDF2會與去甲基化酶FTO競爭，阻止那些熱休克應(yīng)答基因5‘UTR的去甲基化，從而增強這些基因在細(xì)胞質(zhì)中非加帽方式的翻譯(cap-independent translation)。體外實驗發(fā)現(xiàn)，YTHDF2能抑制FTO的去甲基化活性。在Vero細(xì)胞感染實驗中，細(xì)胞感染了enterovirus type 71后，YTHDF1和YTHDF2會上調(diào)，并且在感染12小時后分布在細(xì)胞質(zhì)，感染24小時后分布在細(xì)胞核，這一現(xiàn)象機制不明。

在有絲分裂后期的細(xì)胞中，當(dāng)需要功能蛋白時，YTHDF1的翻譯促進作用就變得特別明顯(Figure 3)。在損傷誘導(dǎo)的軸突再生的背根節(jié)(DRG)模型中，再生相關(guān)基因大量地被甲基化，在這個恢復(fù)過程中，YTHDF1是蛋白質(zhì)強烈合成所必需的條件；相比之下，YTHDF1在損傷前的基礎(chǔ)翻譯增強方面，作用很小。這一現(xiàn)象與最初在HeLa細(xì)胞中研究YTHDF1時類似，YTHDF1會促進一些轉(zhuǎn)錄本的翻譯。在關(guān)于記憶研究方面，有研究發(fā)現(xiàn)，YTHDF1的缺陷會導(dǎo)致海馬依賴性神經(jīng)元功能出現(xiàn)障礙，恢復(fù)YTHDF1的蛋白水平，則能修復(fù)這種問題。YTHDF1依賴的翻譯增強會在一些癌細(xì)胞中持續(xù)出現(xiàn)，而在其它一些細(xì)胞中則是由刺激誘導(dǎo)的，這一過程是如何觸發(fā)的，還不清楚。

讀取器的不同功能

YTHDF1-3的結(jié)構(gòu)類似，它們都含有N末端低復(fù)雜序列，和C末端的保守YTH結(jié)構(gòu)域。但是它們的功能并不相同，在不同的細(xì)胞中，它們有的能促進蛋白翻譯，有的能抑制蛋白翻譯，具體的案例可以參考原文。并且在不同的m6A閱讀器蛋白之間還存在著交叉作用或競爭作用，即使在FTO和閱讀器之間，也有著類似的作用。因為這些蛋白本身就構(gòu)成了一個有相互作用的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因此要理解它們的環(huán)境調(diào)控作用對于相關(guān)的研究有著重要意義。

m6A擦除器

m6A甲基化可以被FTO或ALKBH5逆轉(zhuǎn)，這兩個蛋白也就是m6A擦除器。FTO是第一個被發(fā)現(xiàn)的m6A擦除器。FTO能夠去甲基化m6Am，以及部分mRNA上的cap-m6Am，如Figure 4所示：

CLIP-seq驗證了很多FTO的結(jié)合位點，這些結(jié)合位點包括tRNAs，snRNA等。FTO的空間分布也能發(fā)揮調(diào)控作用，F(xiàn)TO的N末端有一個NLS，它能部分地分布在細(xì)胞核中，也能分布在細(xì)胞質(zhì)中，F(xiàn)TO的分布在不同的細(xì)胞系中有所不同，例如在AML細(xì)胞中的分布和HEK，HeLa細(xì)胞中的分布就不同，這可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，F(xiàn)TO在AML細(xì)胞中的這種分布也有可能是環(huán)境依賴的，因為2HG(2-hydroxy-glutarate)能抑制FTO。

CLIP-seq的測序數(shù)據(jù)分析表明，在某些細(xì)胞系中，F(xiàn)TO偏愛結(jié)合GAC-和/或GGAC模序。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO的表達(dá)和定位可能被PTM調(diào)控（例如Lys-216）。
位于mRNA的5'cap中的+1核糖上，它幾乎是與內(nèi)部m6A(internal m6A，這個內(nèi)部指的是mRNA中間的部分)同時發(fā)現(xiàn)的。m6A可能占據(jù)了整個腺苷酸的0.1%-0.4%，它主要發(fā)生在第二個核苷酸2’-O-methylated()的帽子結(jié)構(gòu)附近。只有不到30%的含有m6Am。m6Am的比例占到整個mRNA的m6A十分之一或更低（在一些細(xì)胞系中還要低）。m6A豐度要遠(yuǎn)高于，因此，雖然FTO更偏愛結(jié)合，但是FTO的主要靶點還是m6A。由于幾乎所有的mRNA帽子結(jié)構(gòu)都在胃鏡核中被加帽蛋白結(jié)合，因此在細(xì)胞核中，cap-不太可能被去甲基化，這也反映了FTO對的局限，如Figure 4所示。現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)的FTO還功能涉及：熱休克應(yīng)答，UV損傷應(yīng)答，HCV感染等方面。

mRNA的甲基化不影響轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定

最初研究認(rèn)為FTO介導(dǎo)的的去甲基化在功能上類似于DCP-2介導(dǎo)的去帽(decapping)化誘導(dǎo)mRNA的降解以及miRNA介導(dǎo)的mRNA降解。當(dāng)敲低FTO后，F(xiàn)TO的靶mRNA出現(xiàn)了很多變化，這些效應(yīng)被認(rèn)為是由于的去甲基化導(dǎo)致的，但是FTO敲低與那些只含有m6A或轉(zhuǎn)錄本水平之間的相關(guān)卻不支持這個結(jié)論，并且發(fā)現(xiàn)只有內(nèi)部m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本的變化與FTO的敲低相關(guān)。

后來發(fā)現(xiàn)了PCIF1是mRNA的甲基轉(zhuǎn)移酶，它只加工，卻不加工內(nèi)部的m6A(internal m6A)。還有研究發(fā)現(xiàn)，PCIF1添加的并不改變基因表達(dá)的水平或轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性，這也不支持剛開始的觀點，即FTO介導(dǎo)的的去甲基化導(dǎo)致的mRNA降解。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FTO敲低時，被認(rèn)為還能促進那些含有mRNA的翻譯效率，但也有一些研究發(fā)現(xiàn)了相反的現(xiàn)象，這一過程的調(diào)控也有可能是與環(huán)境有關(guān)。

ALKBH5的作用與底物

ALKBH5是第二個被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶。ALKBH5在小鼠的精子形成中發(fā)揮了作用，ALKBH5和FTO的表達(dá)在不同組織中各異。例如，在小鼠中，Alkhb5主要表達(dá)在睪丸，而Fto主要表達(dá)在大腦，這可能與它們參與的不同生物學(xué)途徑有關(guān)。在人源細(xì)胞系中敲低ALKBH5后，會誘導(dǎo)其靶RNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)。幾乎所有報道的ALKBH5功能研究都揭示了類似的分子途徑，ALKBH5介導(dǎo)某些轉(zhuǎn)錄本的3'UTR m6A，其中就包括促進缺氧誘導(dǎo)的HIF依賴的乳腺癌干細(xì)胞表型，通過ALKBH5-FOXM1途徑調(diào)節(jié)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖和腫瘤發(fā)生，調(diào)控雄性生殖細(xì)胞中長3'UTR mRNAs的剪接和穩(wěn)定。

結(jié)論與展望

作者在結(jié)論部分中討論了兩個問題，第一個是m6A的調(diào)控，第二個是m6A未解決的一些問題。

其中m6A的調(diào)控功能可能受幾個層面的影響，包括以下幾個方面

第一，m6A的功能取決于細(xì)胞分化和細(xì)胞的發(fā)育狀態(tài)。

第二，m6A的功能可能被環(huán)境因素或細(xì)胞信號觸發(fā)。

第三，m6A效應(yīng)子的定位也影響了m6A的功能。

第四，即使是同一個轉(zhuǎn)錄本，m6A精確的定位和其它的修飾也會影響其功能。

關(guān)于m6A的一些關(guān)鍵問題還沒搞清楚，包括以下幾個方面：

第一，m6A效應(yīng)子針對轉(zhuǎn)錄本的選擇性和m6A位點的選擇性是如何實現(xiàn)的？

第二，m6A效應(yīng)子（包括寫入器，擦除器，讀取器）是如何整合到不同的生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控過程的？