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IP與Co-IP的原理都是借助抗原-抗體之間的專一性作用，形成抗原-抗體復(fù)合物，以此為基礎(chǔ)研究蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法。從下面的流程圖就能看出，Co-IP和IP的實(shí)驗(yàn)過程很類似，Co-IP是對(duì)IP的具體應(yīng)用，二者還是有區(qū)別的。 Co-IP 是通過免疫沉淀獲得已知的蛋白及其互相作用的蛋白，以確定這兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的方法。 (Co-IP流程，圖片來自網(wǎng)絡(luò)) 有了上面的鋪墊，更方便推出今天的主角，Co-IP。 設(shè)想一下。 例如，我們要研究蛋白X和蛋白Y之間是否存在相互作用，可以使用蛋白X的特異性抗體Z去結(jié)合蛋白X，假如蛋白Y能夠與蛋白X結(jié)合后相互作用，那么理論上蛋白X、Y和Z將形成一個(gè)X-Y-Z抗原抗體復(fù)合物。此時(shí)，我們?cè)偈褂胮rotein A-瓊脂糖珠耦合抗體Z，離心后就能得到protein A-瓊脂糖珠-X-Y-Z復(fù)合物，加入上樣緩沖液之后再煮沸，可以將protein A-瓊脂糖珠-X-Y-Z復(fù)合物分解為protein A、瓊脂糖珠、蛋白X、蛋白Y、蛋白Z。然后再通過western blot電泳，可以在條帶上顯示出蛋白的應(yīng)該存在的位置。如果蛋白X和蛋白Y能夠相互作用，那么此時(shí)應(yīng)該能在條帶上蛋白X和蛋白Y正確的分子量位置找到它們的條帶。 (prorein A是從金黃葡萄球菌細(xì)胞壁中分離的蛋白，能特異性的結(jié)合到抗體的Fc段上，最終它可以與抗原、抗體一起形成復(fù)合物，而不影響抗原和抗體間的特異性關(guān)系。) 大致原理如上所述，接下來是原理的分述。 既然是驗(yàn)證生理狀態(tài)下蛋白的相互作用，那么一定是在非變性條件下裂解細(xì)胞，這樣可以將完整細(xì)胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)間相互作用保留下來，而我們常常進(jìn)行的Western Blot是在變性條件下研究蛋白的表達(dá)水平。 如何才能將溫和地釋放細(xì)胞內(nèi)蛋白，盡可能保證它們的原始狀態(tài)呢？ 注意三點(diǎn)即可，第一是溫和地釋放細(xì)胞內(nèi)蛋白，第二是保證釋放出的蛋白不被蛋白酶分解，第三是實(shí)驗(yàn)過程保持低溫。 細(xì)胞裂解必須采用溫和的裂解條件，而不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，一般多采用非離子變性劑如終濃度為NP-40、或者破膜劑TritonX-100。嚴(yán)禁使用高濃度的變性劑0.2％SDS或者含去氧膽酸鈉的裂解液，因?yàn)樗鼈兌紝儆陔x子型去污劑，會(huì)使蛋白變性。如果找不到適合的商用裂解液，可以嘗試自己配制。 保證被釋放的蛋白不被各種蛋白酶裂解是非常重要的。常規(guī)Western Blot實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們會(huì)加入蛋白酶和蛋白磷酸酶抑制劑。在Co-IP實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們需要盡可能地在裂解液中增加蛋白酶抑制劑的種類，并且保證現(xiàn)用現(xiàn)配，例如PMSF在溶液中30分鐘即開始變性失效。 蛋白酶抑制劑可包含PMSF、EDTA、亮抑酶肽、抑蛋白酶肽、胃蛋白酶抑制劑。蛋白磷酸酶抑制劑可包含激活的Na3VO4和NaF。使用的蛋白酶抑制種類并不是一成不變的，假如你要研究磷酸酶活性，顯然不能加入磷酸酶抑制劑。 值得指出的是每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，這需要在前期實(shí)驗(yàn)中充分摸索后敲定。 獲得了這些細(xì)胞裂解物之后，接下來就是加入足量的抗體，4℃緩慢搖床過夜孵育，保證抗體與目標(biāo)蛋白充分接觸。將預(yù)處理過的protein A-瓊脂糖珠加入到已經(jīng)抗體孵育的細(xì)胞裂解液中再次4°C搖床孵育3h，保證抗體與protein A-瓊脂糖珠耦聯(lián)；免疫反應(yīng)結(jié)束后，在4°C離心機(jī)作用下將整個(gè)復(fù)合物離心至管底，小心吸取上清液，這些管底的復(fù)合物用裂解緩沖液沖洗，最后加入SDS上樣緩沖液煮沸，將復(fù)合物分解為單個(gè)的蛋白，即protein A、目標(biāo)蛋白X和蛋白Y、目標(biāo)蛋白X的抗體。然后常規(guī)Western Blot電泳即可。 如果蛋白X和蛋白Y能夠相互作用，那么最終應(yīng)該能在條帶上按照蛋白X和蛋白Y正確的分子量位置找到它們的條帶。 需要提前做的是，在最開始獲取了細(xì)胞裂解物之后要留取一點(diǎn)樣品，跑一下Western Blot，并使用蛋白A、蛋白B各自的特異性抗體確定抗體A和抗體B在條帶上的位置。以此充分論證上述Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 |
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