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經(jīng)過預處理之后的數(shù)據(jù)，就可以進行差異分析了。對于甲基化芯片而言，有兩個方面的差異分析 DMP 差異甲基化探針 DMR 差異甲基化區(qū)域
在ChAMP包中，champ.DMP函數(shù)用于分析差異甲基化探針，champ.DMR函數(shù)用于分析差異甲基化區(qū)域。本章我們先看下差異探針的分析 champ.DMP函數(shù)的用法示例
myDMP <- champ.DMP()
在差異分析時，我們需要兩個輸入數(shù)據(jù)，一個就是探針的表達譜數(shù)據(jù)，beta matrix, 另外一個就是樣本的分組信息。 在champ.DMP函數(shù)中，默認myNorm作為歸一化之后的beta matrix，對于樣本的分組信息，ChAMP默認從Samplesheet.csv文件中讀取，在數(shù)據(jù)導入成功后，myLoad$pd代表的就是SampleSheet.csv文件的信息，所以myLoad$pd$Sample_Group 代表樣本的分組信息。 在差異分析時，最關(guān)鍵的就是差異分組問題。在實驗設計階段，有很多類型的分組設計，比如最常見的case_vs_control, 兩個group的分組;多個組織，比如3個組織，共3個group; 時間序列，比如藥物處理后的幾個時間點。不同的實驗設計，在差異分析時，想要關(guān)注的差異點自然不同，在分析時也要采取不同的分析策略。 對于ChAMP來說，上述的幾種分組設計都是支持。 champ.DMP計算過程分為以下3步：
1. 檢測樣本分組，確定分組比較測試數(shù)據(jù)分成T和C兩組，每組各4個樣本、 在這一步，需要確定兩個因素： 分組的類型
主要識別分組變量是離散型還是連續(xù)型，如果是字符串型character, 就是離散型，如果是數(shù)值型numeric, 就是連續(xù)型。不同的類型，采取的差異分析策略不同。
測試數(shù)據(jù)是字符型的兩個group, 具體的輸入信息如下 分組的個數(shù)
確定group的個數(shù)，2個group 肯定是兩者之間進行差異分析，但是當group 個數(shù)3個或以上時，就需要確定如何分組比較。 默認情況下兩兩之間都進行差異分析，如果你不需要這么多的差異結(jié)果，可以通過compare.group 參數(shù)指定， compare.group參數(shù)的值是一個list, list 中的每個元素是一個長度為2的向量，指定了用于差異分析的兩個group
[ Section 1: Check Input Pheno Start ]
You pheno is character type.
Your pheno information contains following groups. >>
C:4 samples.
T:4 samples.
[The power of statistics analysis on groups contain very few samples may not strong.]
pheno contains only 2 phenotypes
compare.group parameter is NULL, two pheno types will be added into Compare List.
C_to_T compare group : C, T
[ Section 1: Check Input Pheno Done ]
進行差異探針分析通過調(diào)用limma 函數(shù)進行差異分析，默認通過BH方法進行多重建設檢驗的校正，p.adjust < 0.05 的認為是差異探針 可以通過adjPVal參數(shù)修改p.adjust的閾值，當然也可以修改adjust.method 參數(shù)的值，調(diào)整多重假設檢驗校正的算法，默認值為BH, 可選值包括 “none”, “BH”, “BY”, “holm”。 [ Section 2: Find Differential Methylated CpGs Start ]
Start to Compare : C, T
Contrast Matrix
Contrasts
Levels pT-pC
pC -1
pT 1
You have found 4283 significant MVPs with a BH adjusted P-value below 0.05.
Calculate DMP for C and T done.
[ Section 2: Find Numeric Vector Related CpGs Done ]
添加差異探針的注釋信息之前的分析都是針對探針的beta matrix 進行的分析，找的差異探針之后，我們肯定希望知道這個探針對應的基因，染色體位置等注釋信息。這一步實際就是在已有的差異結(jié)果的基礎上，追加探針的注釋信息。 [ Section 3: Match Annotation Start ]
[ Section 3: Match Annotation Done ]
結(jié)果展示str(myDMP)
List of 1
$ C_to_T:’data.frame’: 4283 obs. of 23 variables:
..$ logFC : num [1:4283] 0.724 …
..$ AveExpr : num [1:4283] 0.398 …
..$ t : num [1:4283] 28.2 …
..$ P.Value : num [1:4283] 1.74e-08…
..$ adj.P.Val : num [1:4283] 0.00703…
..$ B : num [1:4283] 7.6 7.05 …
..$ C_AVG : num [1:4283] 0.0358 …
..$ T_AVG : num [1:4283] 0.759 …
..$ deltaBeta : num [1:4283] 0.724 …
..$ CHR : Factor w/ 25 levels “”,”1”,”10”,”11”,..:
..$ MAPINFO : int [1:4283] 141516291 …
..$ Strand : Factor w/ 3 levels “”,”F”,”R”: 3 2 …
..$ Type : Factor w/ 2 levels “I”,”II”: 2 2 …
..$ gene : Factor w/ 20622 levels “”,”A1BG” …
..$ feature : chr [1:4283] “Body” “Body” …
..$ cgi : Factor w/ 4 levels “island”,”opensea”,..: …
..$ feat.cgi : Factor w/ 28 levels “1stExon-island”,..: 13 …
..$ UCSC_CpG_Islands_Name: Factor w/ 27177 levels “”,”chr1:10003165-10003585”,..: 18278 …
..$ DHS : logi [1:4283] NA NA NA NA NA NA …
..$ Enhancer : logi [1:4283] TRUE TRUE NA NA NA NA …
..$ Phantom : Factor w/ 11912 levels “”,”high-CpG:100009860- …
..$ Probe_SNPs : Factor w/ 56004 levels “”,”rs10000615”,..:
..$ Probe_SNPs_10 : Factor w/ 35790 levels “”,”rs10000804” …
myDMP 就是最終的差異分析結(jié)果，是一個list對象，list中的每個元素是兩個group之間差異分析的結(jié)果。
測試數(shù)據(jù)只有兩個分組，所以list 中只有一個元素。差異分析的結(jié)果是一個data.frame對象，可以分成3個部分。 從logFC到B的部分是limma 差異輸出結(jié)果， C_AVG到deltaBeta是每組表達量的均值，deltaBate是兩組均值的差，CHR到Probe_SNPs_10是探針的注釋信息。
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