自噬與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

1  不同病因?qū)е碌母螕p傷中細胞自噬的作用機制

我國肝癌發(fā)生的原因多見于慢性HBV和HCV感染，此外還與酒精性及非酒精性脂肪肝相關(guān)。HBV誘導(dǎo)的肝細胞自噬通常是由HBVx蛋白（HBx）誘導(dǎo)的，HBx是HBVx基因編碼的一種多功能潛在性腫瘤蛋白，在慢性肝炎、肝硬化和肝癌中發(fā)揮重要作用。HBx可通過抑制Beclin 1與bcl-2結(jié)合和JNK-ROS信號通路啟動自噬。其他HBV蛋白如HBsAg可通過與折疊錯誤的蛋白結(jié)合（即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)）誘導(dǎo)自噬。但有趣的是，自噬的發(fā)生在肝癌中的作用是一個復(fù)雜的雙向調(diào)節(jié)過程，雖然HBx和HBsAg可通過不同途徑啟動和誘導(dǎo)自噬發(fā)生，但HBx在體內(nèi)同時發(fā)揮出另一方面的作用，通過對ATP酶與mTOR的誘導(dǎo)，導(dǎo)致溶酶體酸化和降解能力降低，兩方面共同作用下，最終體內(nèi)自噬作用是減弱的。自噬啟動的增加及溶酶體工作能力的降低，共同導(dǎo)致了p62堆積，從而促進病毒感染，導(dǎo)致肝細胞壞死及凋亡增加。而p62的異常堆積可活化核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（Nrf2），啟動抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，使肝細胞在氧化應(yīng)激條件下增加癌變風(fēng)險。

LIU B, FANG M, HU Y, et al. Hepatitis B virus X protein inhibits autophagic degradation by impairing lysosomal maturation［J］. Autophagy, 2014, 10(3): 416-430.

HCV相關(guān)肝癌發(fā)生發(fā)展的過程中，細胞自噬的作用較為復(fù)雜，其促進肝癌的機制可能與促進病毒復(fù)制及擴散有關(guān)，此外還與增加肝癌細胞對化療藥物抵抗能力相關(guān)。研究表明，自噬形成的雙層膜結(jié)構(gòu)可能為HCV翻譯提供了場所和原料。HCV非結(jié)構(gòu)蛋白4B(NS4B)與Vps34、Ras相關(guān)蛋白5(Rab5,一種小GTP 酶家族的成員)結(jié)合形成復(fù)合物，正向調(diào)控自噬發(fā)生，但抑制自噬前體形成及自噬溶酶體降解，導(dǎo)致異常蛋白質(zhì)降解能力減弱，自噬降解能力減弱可導(dǎo)致HCV復(fù)制增加，肝細胞內(nèi)病毒堆積，細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，進而肝細胞脂肪變性增加，肝細胞壞死、癌變可能增加。

同樣的，高脂飲食則會導(dǎo)致機體自噬受損，從而加速非酒精性脂肪肝向肝癌發(fā)展。高脂飲食影響自噬的機制可能是活化mTOR或抑制AMPK，進而抑制自噬起始復(fù)合物ULK1形成。在小鼠模型和體外實驗中，通過敲除ATG5或使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤后，小鼠肝細胞中甘油三酯和膽固醇含量明顯增多，形成脂滴，且肝細胞脂肪變性增多。另有研究表明，高脂飲食環(huán)境下，活性氧自由基增多，肝細胞內(nèi)CD4+T淋巴細胞凋亡增加，抗腫瘤免疫效應(yīng)減弱。

酒精性脂肪肝到原發(fā)性肝癌的發(fā)展過程中，細胞自噬起先是被促進的，但后來則轉(zhuǎn)為抑制。在急性乙醇暴露環(huán)境下，肝細胞自噬增加，此時自噬作為一種保護機制，清理大量受損線粒體和ROS自由基，促進乙醇代謝等。乙醇被氧化分解代謝主要是通過肝臟乙醇脫氫酶和細胞色素P4502E1催化反應(yīng)。但在用乙醇處理人肝癌細胞的模型中，觀察到細胞色素P4502E1抑制了細胞自噬，并促進了脂質(zhì)堆積，其機制可能是慢性乙醇暴露環(huán)境下，長期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，自噬效應(yīng)減弱，溶酶體融合、降解自噬小體能力降低，因為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含自噬小體形成需要的膜結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)。

2  細胞自噬抑制肝癌發(fā)生

自噬可以抑制慢性肝炎或肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)變，而自噬缺乏則可能會導(dǎo)致肝癌發(fā)生。小鼠饑餓實驗中，24 h內(nèi)小鼠肝臟35%的蛋白質(zhì)經(jīng)自噬途徑降解。Takamura等研究中，ATG5或ATG7基因缺失的6~9月齡小鼠模型發(fā)生肝腫大或肝腫瘤，并且肝癌細胞中有大量泛素化蛋白堆積，而正常肝細胞則沒有；肝腫瘤發(fā)生可能起源于自噬缺失的肝細胞，具體機制可能與線粒體腫脹、p62堆積、氧化應(yīng)激、DNA損傷反應(yīng)等有關(guān)。此外，在ATG7缺乏的小鼠模型中特異性下調(diào)p62表達后，肝腫瘤體積減小，表明p62堆積對肝癌發(fā)生可能起促進作用。Bao等研究發(fā)現(xiàn)，在石蠟包埋的肝癌組織切片中發(fā)現(xiàn)肝癌細胞中有p62蛋白堆積，但周圍未發(fā)生癌變的正常肝細胞中則未發(fā)現(xiàn)p62的異常堆積。

此外，自噬還可通過調(diào)控免疫來發(fā)揮抗腫瘤作用。多種人類實體腫瘤細胞中都存在自噬活性的改變，且研究表明自噬與腫瘤免疫應(yīng)答具有很大的相關(guān)性。在腫瘤固有免疫中，自噬可參與腫瘤相關(guān)巨噬細胞分化，進而影響腫瘤新生血管生成、免疫抑制和侵襲轉(zhuǎn)移，當自噬受抑制時，巨噬細胞向M2型分化，促進腫瘤血管生成；反之巨噬細胞向M1型分化，抑制腫瘤進展。在腫瘤特異性免疫中，自噬在T淋巴細胞存活、發(fā)育、穩(wěn)態(tài)及功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，有研究表明自噬缺陷的T淋巴細胞內(nèi)線粒體數(shù)量異常增加，ROS增加，所以自噬可能通過細胞穩(wěn)態(tài)影響T淋巴細胞發(fā)揮功能；還有研究表明自噬缺陷的B祖細胞不能發(fā)育成為前體B淋巴細胞；自噬還可參與抗原遞呈過程，一方面自噬形成的降解產(chǎn)物可以被遞呈到主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ或Ⅱ類分子表面增強特異性免疫應(yīng)答，另一方面，腫瘤自噬小體可作為樹突狀細胞（DC）的交叉遞呈抗原，更有效地提升CD8+ T淋巴細胞應(yīng)答能力。

肝癌中腫瘤免疫與自噬的關(guān)系尚未完全明確。研究表明，缺乏自噬的肝臟Kupffer細胞可以通過mtROS-NF-κB-IL-1a/b通路促進肝硬化和肝癌發(fā)展。自噬缺陷協(xié)同脂質(zhì)堆積可造成肝內(nèi)CD4+T淋巴細胞耗竭。細胞自噬還被證實可被誘導(dǎo)增強TGFβ介導(dǎo)的抗腫瘤作用，IFNγ可通過非凋亡性細胞死亡抑制Huh7肝癌細胞增殖，敲除自噬后，IFNγ抑制肝癌細胞增殖和誘導(dǎo)肝癌細胞死亡的作用消失。

此外，另有研究表明自噬可通過抑制抑癌基因的表達或活化原癌基因促進肝癌發(fā)生。在ATG5敲除的小鼠模型中，由于自噬缺陷，抑癌基因p53表達增加，小鼠只發(fā)生肝良性腫瘤而不惡變。這進一步提示，自噬在肝癌發(fā)生中的作用及機制非常復(fù)雜，可能受到諸多因素調(diào)控，但其重要性則毋庸置疑，仍需更多的研究探索其機制。

GUO JY, XIA B, WHITE E. Autophagy-mediated tumor promotion［J］. Cell, 2013, 155(6): 1216-1219

3  細胞自噬促進肝癌發(fā)展

一旦腫瘤發(fā)生后，細胞自噬則轉(zhuǎn)為促進肝癌發(fā)展的作用。首先可能與自噬維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、提供營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)，這成為肝癌發(fā)展的一大促進條件。腫瘤細胞代謝高，且多處于低氧低pH環(huán)境，而細胞自噬使腫瘤細胞在饑餓、應(yīng)激反應(yīng)狀況下通過降解各種受損細胞器、異常蛋白質(zhì)得以存活。研究表明在低氧環(huán)境下，50%~60%的腫瘤細胞中自噬活動明顯增多。一項針對156例肝癌患者的研究證實LC3-Ⅱ的自噬表達水平隨著肝癌病程延長而增加，且與惡性轉(zhuǎn)移和低生存率呈正相關(guān)。其次自噬還可通過提高肝癌細胞的化療抗性等促進腫瘤發(fā)展，如自噬基因Beclin 1或ATG5缺失時，索拉非尼的殺傷腫瘤細胞能力更強，且抗腫瘤增殖能力也提高。還有研究表明，烏司他丁可抑制肝癌細胞SMMC-7721自噬，從而減弱表柔比星治療肝癌時的化療抵抗。

自噬與肝癌免疫治療

肝癌預(yù)后差，目前治療手段有限及臨床療效不佳也是主要原因，免疫治療研究的顯著進展為尋找肝癌新的治療手段指明了方向。腫瘤免疫治療主要包括免疫檢查點抑制劑治療、過繼免疫細胞治療和腫瘤疫苗等。多項研究表明自噬不僅影響調(diào)節(jié)性T淋巴細胞、抗原遞呈細胞、腫瘤相關(guān)巨噬細胞等免疫細胞的發(fā)育生長及主要組織相容性復(fù)合物抗原遞呈過程，還可影響細胞因子的產(chǎn)生、趨化作用等。鑒于自噬在肝癌發(fā)生發(fā)展過程和機體免疫中的重要作用，研究自噬的作用機制可能為肝癌免疫治療找到新的靶點。

1  免疫檢查點抑制劑治療

免疫逃逸是指腫瘤逃避了機體免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，在機體生存并增殖的狀況，免疫檢查點蛋白失調(diào)是免疫逃逸的主要機制之一。現(xiàn)研究較多的免疫檢查點主要有程序性死亡蛋白1（PD-1）及其配體（PD-L1）以及細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4（CTLA4）。

研究發(fā)現(xiàn)PD-1可抑制自噬途徑，并促進肝癌發(fā)生，可能機制是與mTOR下游分子核糖體蛋白分子S6(RPS6)和真核起始因子4E（eIF4E）結(jié)合，促進其磷酸化，經(jīng)此途徑調(diào)節(jié)自噬，聯(lián)合PD-1抗體和mTOR抑制劑可以產(chǎn)生比各自單獨更強的抗肝癌效應(yīng)。PD-1和PD-L1結(jié)合后可阻斷T淋巴細胞增殖、活化和產(chǎn)生細胞因子，因此阻斷該途徑可破壞腫瘤的免疫逃逸。其中PD-1抗體nivolumab治療肝癌已完成Ⅰ、Ⅱ期試驗（NCT01658878），證明了該藥物的有效性、安全性可控，基于此在2017年已被美國食品與藥品管理局列為肝癌的二線用藥；另一抗體pembrolizumab現(xiàn)處于肝癌治療的Ⅲ期試驗（NCT02702401）。現(xiàn)用于肝癌治療的PD-L1抗體主要有Avelumab、At-ezolizumab和Durvalumab，均處于Ⅰ期或Ⅱ期試驗（NCT02519348）。

EL-KHOUEIRY AB, SANGRO B, YAU H, et al. Nivolumab in patients with advanced hepatocellular carcinoma (CheckMate 040): An open-label, non-comparative, phase 1/2 dose escalation and expansion trial［J］. Lancet, 2017, 389(10088): 2492-2502.

關(guān)于自噬調(diào)節(jié)CTLA4進而影響腫瘤免疫逃逸的研究尚未報道。CTLA4介導(dǎo)的免疫逃逸機制是表達于活性T淋巴細胞表面的CTLA4可以與配體B7結(jié)合使T淋巴細胞活性受到抑制，腫瘤產(chǎn)生免疫逃逸。針對肝癌的CTLA4抗體主要有ipilimumab和tremelimumab，目前均處于臨床試驗中（NCT02519348、NCT0100835854I），但相比于PD-1抗體的研究，CTLA4抗體的安全性、耐受性等研究仍淺。

2  過繼免疫細胞治療

過繼免疫細胞治療是指將具有抗腫瘤效應(yīng)的自體或異體細胞在體外進行誘導(dǎo)、激活或修飾并擴增后回輸給腫瘤患者，再轉(zhuǎn)移到病灶，以達到治療及預(yù)防復(fù)發(fā)之目的，常用的過繼細胞有細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（CIK）、腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）以及基因修飾T淋巴細胞。自噬可促進自然殺傷細胞（NK細胞）成熟，并調(diào)節(jié)NK細胞內(nèi)部穩(wěn)態(tài)和抗腫瘤作用，且自噬可通過細胞因子途徑或ROS途徑調(diào)控T淋巴細胞胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、免疫功能及記憶T淋巴細胞的產(chǎn)生等，故理論上來說自噬在該治療中影響較大，但可能該治療現(xiàn)開展較少，尚未有針對自噬的藥物聯(lián)合其治療肝癌的研究報道。

針對肝癌的CIK過繼免疫細胞療法的Ⅲ期試驗已經(jīng)展開。一項韓國的研究顯示，肝癌常規(guī)治療（手術(shù)、射頻消融、化療）后導(dǎo)入經(jīng)活化的CIK治療（包括表達CD3+CD56+T淋巴細胞和CD3+CD56-T淋巴細胞及CD3-CD56+NK細胞）可明顯提高230例患者的無復(fù)發(fā)生存率和總生存率（NCT00699816）。

一項納入17例TIL治療肝癌的 Ⅰ 期試驗結(jié)果顯示：2例患者未檢測到TIL擴增，在14個月的中位生存期后3例患者復(fù)發(fā)，其余12例未見腫瘤復(fù)發(fā)，且該試驗中TIL表現(xiàn)出了低毒性。

嵌合抗原受體T淋巴細胞(CART)免疫療法是過繼免疫細胞療法使用基因修飾T淋巴細胞中的一種，其在淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤治療中取得了卓越的成效，在肝癌治療中的研究正在開展。一項修飾后定向CD133的CART治療的Ⅰ期試驗中，納入的23例患者包括14例肝癌患者，7例胰腺癌患者，2例結(jié)直腸癌患者，體現(xiàn)了CART-CD133在治療CD133+腫瘤患者時具有穩(wěn)定的療效，尤其是針對晚期轉(zhuǎn)移患者，且毒性在可控范圍內(nèi)。

針對肝癌的過繼免疫細胞療法現(xiàn)仍需深入研究，自噬在該療法中的影響研究尚未報道，但鑒于自噬對免疫細胞穩(wěn)態(tài)維持及功能調(diào)控的重大影響，探究自噬在其中的機制可能能為這方面的研究提供一個方向。

3  腫瘤疫苗

目前，預(yù)防肝癌發(fā)生或腫瘤進展的疫苗研究正在開展，其中已報道過自噬在其中產(chǎn)生影響的疫苗有自噬相關(guān)基因疫苗、DC疫苗、病毒疫苗和腫瘤抗原疫苗。

如前所述，自噬在早期階段主要起抑制肝癌發(fā)生作用，但在后期發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中則主要起促進作用，有研究表明針對自噬配體蛋白p62的編碼DNA的疫苗可以有效抑制肝癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，但該實驗僅停留在狗、大鼠和小鼠模型，僅在大鼠模型中進行了最小毒性劑量的測定。

使用腫瘤細胞源自噬體刺激DC產(chǎn)生的疫苗研究表明，相比于僅接種DC疫苗的肝癌小鼠模型，接種腫瘤細胞源自噬體刺激獲得的成熟DC疫苗的小鼠出現(xiàn)明顯的特異性T淋巴細胞反應(yīng)，抗腫瘤效應(yīng)顯著，腫瘤生長明顯受到抑制。

自噬在HBV相關(guān)HCC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，且與HBx關(guān)系密切，一項關(guān)于攜帶HBx表達基因的腺病毒載體疫苗的研究表明，該疫苗可使肝癌細胞表達HBx，并通過自噬途徑誘發(fā)增強CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞的抗腫瘤免疫效應(yīng)。

有研究表明，肝癌的特異性抗原AFP在肝癌細胞中抑制細胞自噬和細胞凋亡，進而促進腫瘤增殖轉(zhuǎn)移，其機制可能是通過PI3K/Akt/mTOR途徑。一項AFP衍生的疫苗I期試驗中，納入15例肝癌患者，觀察期為730 d，5例患者檢測到了明顯的免疫應(yīng)答反應(yīng)，8例患者病情維持穩(wěn)定，腫瘤增長速度減緩，無不良事件發(fā)生（UMIN000003514）。

疫苗是預(yù)防肝癌發(fā)生或腫瘤進展較為經(jīng)濟有效的方式，上述幾種疫苗都與自噬關(guān)系密切，故明確自噬在其中的具體機制可能有益于新疫苗的研發(fā)，可能為肝癌預(yù)防提供潛在的靶點。

4  其他治療

針對肝癌的免疫治療還包括特異性抗體治療，主要原理是介導(dǎo)抗體依賴的細胞毒作用。CD147在肝癌腫瘤邊緣高表達，并介導(dǎo)腫瘤增殖，多克隆抗體HAb18可以特異性識別，基于此原理，有研究設(shè)計了一種可以表達HAb18和具有腫瘤殺傷效應(yīng)的細胞因子IL-24的溶瘤腺病毒（自身表達ZD55），實驗發(fā)現(xiàn)ZD55- HAb18- IL24可通過誘導(dǎo)細胞凋亡和細胞自噬抑制肝癌細胞生長，且效果比單一使用抗體好。還有研究表明，一種攜帶TSLC1抑癌基因的溶瘤腺病毒可靶向Wnt信號通路使腫瘤細胞發(fā)生細胞自噬、凋亡等從而抑制腫瘤生長，可延長小鼠模型的生存期，該研究則從基因?qū)用嬲{(diào)控了腫瘤代謝。