撰文 ∣ William G. Kaelin Jr

編譯 ∣ 李娟

識(shí)別藥物靶點(diǎn)并檢驗(yàn)其有效性是抗癌藥物進(jìn)入臨床前研究的關(guān)鍵。目前，有關(guān)癌癥靶點(diǎn)的最新研究層出不窮，但良莠不齊，存在不少問題，比如結(jié)論無法被重復(fù)驗(yàn)證、數(shù)據(jù)分析邏輯欠佳等。本文就癌癥靶點(diǎn)驗(yàn)證研究中普遍存在的缺點(diǎn)及可能的解決方法做出闡明。

隨著癌癥研究數(shù)據(jù)的爆發(fā)出現(xiàn)，在挖掘有意義結(jié)論的過程中，區(qū)分相關(guān)性和因果關(guān)系是至關(guān)重要的。生物學(xué)中有許多例子：兩個(gè)相互關(guān)聯(lián)的事物并不存在因果關(guān)系，有時(shí)是因?yàn)槎叨继幱谏嫌慰刂埔蛩刂?，有時(shí)二者只是偶然相關(guān)。

在描述因果關(guān)系時(shí)，有兩個(gè)詞特別有用：必要性和充分性。甲對(duì)乙是必要的，意味著如果甲不存在，乙就不可能是真的；甲對(duì)乙是充分的，意味著如果甲是真的，乙也會(huì)是真的——這對(duì)得出符合邏輯的結(jié)論是非常關(guān)鍵的。

例如，在惡性黑色素瘤中首次發(fā)現(xiàn)BRAF突變時(shí)，一些人認(rèn)為BRAF突變不是好的藥物靶點(diǎn)，因?yàn)槠湓诹夹责胫幸泊嬖?。但這僅表明BRAF突變不足以引起惡性黑色素瘤，臨床上我們更應(yīng)看重的是BRAF的活性是否是BRAF突變黑色素瘤發(fā)展所必需的，這個(gè)問題現(xiàn)在已經(jīng)得到肯定的回答。

此外，多重基因突變往往是癌癥發(fā)生發(fā)展的必要條件，但并不說明必須聯(lián)合使用靶向每個(gè)突變的藥物才能充分治療癌癥。比如，盡管還存在其他誘發(fā)因素，但是在p53突變的腫瘤中恢復(fù)p53的功能就足以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。聯(lián)合用藥的原因常是出于對(duì)耐藥性的考量。因此，研究者一定要清晰地判斷必要性和充分性，得出恰當(dāng)?shù)囊蚬P(guān)系。

無法正確判斷因果，就容易曲解癌癥新藥靶點(diǎn)的研究數(shù)據(jù)。例如，當(dāng)發(fā)現(xiàn)某個(gè)靶點(diǎn)的表達(dá)與患者的不良結(jié)果相關(guān)，研究者表述結(jié)論時(shí)常暗示不良結(jié)果是該靶點(diǎn)引起的——這是不合理的。舉個(gè)例子，就慢性肺病患者來說，需要呼吸機(jī)的病人相比不需要呼吸機(jī)的病人來說，病情往往更嚴(yán)重、表現(xiàn)更差，但解釋數(shù)據(jù)時(shí)我們肯定不會(huì)認(rèn)為這是呼吸機(jī)引起的。相反，需要呼吸機(jī)標(biāo)示著病情發(fā)展到了更晚期的階段。

在癌癥生物學(xué)中，許多分子水平的變化與癌癥侵襲性的增加有關(guān)，但這些分子不一定就是導(dǎo)致癌癥侵襲性的原因。例如，缺氧誘導(dǎo)因子 (HIF) 的上調(diào)表達(dá)總是與患者的不良預(yù)后相關(guān)，這既可能意味著HIF導(dǎo)致某些腫瘤更具侵襲性，但也可能意味著，腫瘤生長缺乏血氧供應(yīng)，才使得HIF上調(diào)。在后一種情況下，缺氧、缺氧誘導(dǎo)因子和不良預(yù)后之間存在因果關(guān)系，但因果關(guān)系方向與前一種推斷正好相反。再如，雌激素受體（ER) 陽性的乳腺癌患者比ER陰性的患者的預(yù)后更好，并不是因?yàn)镋R抑制癌細(xì)胞生長，而是ER驅(qū)動(dòng)的乳腺癌比其他亞型更具惰性。事實(shí)上，ER是最有效的癌癥治療靶點(diǎn)之一。

總之，一個(gè)因素與不良預(yù)后相關(guān)，并不足以判斷它是否能作為癌癥治療的靶點(diǎn)。即，與不良預(yù)后相關(guān)，并非選擇靶點(diǎn)的必要且充分條件。

那么，兩個(gè)事物之間的因果關(guān)聯(lián)是如何確定的呢？通常是去干擾一個(gè)事物，同時(shí)測(cè)量另一個(gè)事物受到的影響。例如，當(dāng)使用遺傳或化學(xué)方法破壞蛋白A的功能，導(dǎo)致表型B喪失，說明蛋白A的活性對(duì)于B是必需的。當(dāng)激活蛋白A，總是產(chǎn)生表型B，說明對(duì)于B來說，A是充分的。當(dāng)然，這類實(shí)驗(yàn)并不能區(qū)分直接影響和間接影響，其機(jī)制將通過生化研究或結(jié)構(gòu)研究得以補(bǔ)充。

然而，我們?cè)谖墨I(xiàn)中常見到基于生物學(xué)上的合理性對(duì)因果關(guān)系進(jìn)行推斷——“甲與乙相關(guān)，甲導(dǎo)致乙是合理的，因此甲導(dǎo)致乙?！?span style="font-size: 16px;color: rgb(63, 63, 63);">例如，有論文做出結(jié)論說：“高水平HIF與癌癥不良預(yù)后相關(guān)，很可能是高水平的HIF上調(diào)了那些促進(jìn)血管生成的基因和腫瘤侵襲的基因，如血管內(nèi)皮生長因子A (VEGFA) 和基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMPs) ?！钡?，這個(gè)論點(diǎn)忽略了HIF也上調(diào)抑制蛋白合成的基因和促進(jìn)自噬的基因，而這類基因又是可以抑制腫瘤的。事實(shí)上，在某些模型中HIF促進(jìn)腫瘤生長，在另一些模型中則抑制腫瘤生長。

類似地，癌癥靶向藥物發(fā)揮作用時(shí)，并不代表藥物一定是通過抑制其預(yù)期靶點(diǎn)來殺死癌細(xì)胞的。例如，在臨床前模型中，MELK（母體胚胎亮氨酸拉鏈激酶）的小分子抑制劑能較好地抑制腫瘤增殖，因此進(jìn)入臨床試驗(yàn)，制成抑制劑藥物。然而Sheltzer等最近發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用CRISPR- Cas9去除細(xì)胞模型中的MELK，細(xì)胞仍然能夠存活，而且還能對(duì)至少一種MELK抑制劑保持敏感，這顯然表明該抑制劑藥物并不是通過抑制MELK殺死細(xì)胞的。可見，基于相關(guān)性和合理性來推斷因果是不恰當(dāng)?shù)摹?/span>

在癌癥生物學(xué)和癌癥藥理學(xué)進(jìn)行表型分析時(shí)，必要性和充分性的概念也非常有用。

表型分析可以分為“上行分析” (up assays) 和“下行分析” (down assays) 兩類。在上行分析中，人們找的是被測(cè)讀數(shù)的增加，例如酶活性的增強(qiáng)或細(xì)胞適應(yīng)性的增強(qiáng)，而在下行分析中，人們找的是被測(cè)讀數(shù)的減少，例如被測(cè)蛋白水平的降低或細(xì)胞適應(yīng)性的降低。

在提供生物學(xué)見解方面，上行分析通常優(yōu)于下行分析，因?yàn)樯闲蟹治龅男旁氡雀鼉?yōu)，假陽性更少。對(duì)于給定的表型來說，必需的東西越多，該表型就越容易被損害。換句話說，降低系統(tǒng)性能的方法要比提高系統(tǒng)性能的方法更多。出于這些原因，進(jìn)行高通量化學(xué)篩選和基因篩選的生物學(xué)家往往更喜歡上行分析。

然而，癌癥科學(xué)家使用的表型分析幾乎總是下行分析。例如，干擾癌細(xì)胞中特定蛋白質(zhì)的功能，會(huì)降低細(xì)胞的生存力、增殖力、侵襲力或致瘤性（圖1）。但我們同樣需要知道，任何降低細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)性或適應(yīng)性的因素都可能催生上述下行結(jié)果。

圖1 癌癥生物學(xué)和癌癥藥理學(xué)中常用的下行表型分析。a, 基于分析物(蛋白質(zhì)或磷酸表位)水平下降的藥效學(xué)試驗(yàn)。注意如果分析物的半衰期短于正常對(duì)照(通常情況下)，分析物水平的下降可能與特異性毒性藥物無關(guān)，且會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄或翻譯的整體下降。b, 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。c, 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)。d, 體外血管生成實(shí)驗(yàn)。e, 體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。f, 體內(nèi)腫瘤發(fā)生發(fā)展實(shí)驗(yàn)（如皮下異種移植）。g, 體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)（如尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞后進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)）。

那么，癌癥生物學(xué)的研究可以實(shí)現(xiàn)上行分析嗎？答案是肯定的。目前，很多癌癥藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)是基于分析物（例如磷酸表位）的下調(diào)，那么，找到藥物與靶點(diǎn)接觸時(shí)快速誘導(dǎo)升高的分析物，就可以成為藥效上行分析的依據(jù)。類似思路也適用于癌癥生物學(xué)的化學(xué)和基因篩選實(shí)驗(yàn)。如果某個(gè)信號(hào)通路在正常細(xì)胞中致癌，但在報(bào)告細(xì)胞中抑癌或降低細(xì)胞適應(yīng)性，那么就可以在報(bào)告細(xì)胞中通過上行分析來篩選抑制劑，而所用報(bào)告細(xì)胞可以是自然存在的也可以是經(jīng)過分子工程改造的。

此外，癌癥科學(xué)家通常使用化學(xué)物、siRNAs、shRNAs和sgRNA等來干擾癌細(xì)胞中特定靶點(diǎn)的功能，最終產(chǎn)生的表型既可能源自于干擾物對(duì)靶點(diǎn)的影響，也可能源自于對(duì)非靶點(diǎn)的影響，甚至對(duì)兩者的共同影響。在細(xì)胞分析中，當(dāng)發(fā)現(xiàn)某一干擾物導(dǎo)致下行表型時(shí)，應(yīng)該同時(shí)考慮是否存在破壞細(xì)胞適應(yīng)性的非靶點(diǎn)效應(yīng)。干擾物可能達(dá)到了預(yù)期的藥效學(xué)結(jié)論，并且產(chǎn)生了生物學(xué)合理的表型，但是這并不證明干擾物是通過結(jié)合靶點(diǎn)而導(dǎo)致該表型的——這是基于相關(guān)性和合理性推斷因果關(guān)系的又一個(gè)反例。

癌癥科學(xué)家需要明確一點(diǎn)：要證明因果關(guān)系，需要更多的步驟。

表型拯救實(shí)驗(yàn)是證明藥靶因果關(guān)系的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)。例如，甲磺酸伊馬替尼是ABL激酶活性抑制劑藥物，它通過抑制致病性BCR-ABL融合蛋白來殺死慢性髓性白血病 (CML) 細(xì)胞，而該藥物靶向作用的證實(shí)，則來自帶有BCR-ABL突變體的CML細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的證據(jù)。

制備耐藥靶點(diǎn)突變體的方法有數(shù)種。例如，將表達(dá)靶點(diǎn)的哺乳動(dòng)物cDNA載體導(dǎo)入特定大腸桿菌中用以積累錯(cuò)義突變，然后將隨機(jī)突變的表達(dá)載體庫導(dǎo)入對(duì)藥物敏感的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。加藥后，篩選并擴(kuò)增抗性細(xì)胞克隆，再對(duì)相應(yīng)的表達(dá)載體進(jìn)行測(cè)序，之后進(jìn)一步測(cè)試鑒定出的突變體是否確實(shí)拮抗藥物的生化作用，或者將突變體導(dǎo)入幼稚細(xì)胞之后觀察能否產(chǎn)生抗藥表型（圖2a）。

Tarun Kapoor及同事開發(fā)了一種鑒定耐藥突變體的方法，該方法不需要事先了解相關(guān)藥物靶點(diǎn)。Deepak Nijhawan及同事進(jìn)一步優(yōu)化了該方法。在優(yōu)化方法中，他們用藥物去處理充滿錯(cuò)義突變、存在天然錯(cuò)配修復(fù)缺陷的藥物敏感細(xì)胞，篩出抗性細(xì)胞并克隆擴(kuò)增，再進(jìn)行RNA-seq和全外顯子測(cè)序，以鑒定潛在的耐藥基因并加以驗(yàn)證（圖2b）。如果天然存在的MMR缺陷細(xì)胞系對(duì)所研究藥物不敏感，或者其生物學(xué)特性不適合該方法，原則上可通過CRISPR-Cas9技術(shù)制備MMR缺陷細(xì)胞 (刪除一個(gè)或多個(gè)MMR基因) 。類似的，Stephen Jackson及同事也報(bào)道了利用化學(xué)誘變單倍體哺乳動(dòng)物細(xì)胞來鑒定耐藥靶基因的方法。

圖2 制備耐藥突變體的方法（點(diǎn)擊看大圖）

在應(yīng)用遺傳干擾物如siRNA、shRNA和sgRNA的實(shí)驗(yàn)中，可同時(shí)導(dǎo)入表達(dá)靶點(diǎn)cDNA的載體來進(jìn)行表型拯救。所用載體需不含干擾物結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)干擾物不敏感。另一種逆轉(zhuǎn)靶點(diǎn)表型的方法是恢復(fù)靶點(diǎn)下游的效應(yīng)子功能。例如，激活BRAF下游的MEK1，可以使BRAF突變黑色素瘤細(xì)胞對(duì)BRAF抑制劑產(chǎn)生抗性。在這類表型拯救實(shí)驗(yàn)中，事先了解靶點(diǎn)下游效應(yīng)子及其功能是非常重要的。

為了進(jìn)一步明確功能喪失（或功能獲得）是遺傳干擾物作用于靶點(diǎn)所致，還可以測(cè)試相應(yīng)的功能獲得（或功能喪失）實(shí)驗(yàn)是否會(huì)導(dǎo)致相反的表型。例如，如果敲除靶點(diǎn)能夠抑制腫瘤生長，那么過表達(dá)靶點(diǎn)則會(huì)促進(jìn)腫瘤生長。但要注意一些靶點(diǎn)的表型效應(yīng)可能與其表達(dá)水平或活性強(qiáng)弱沒有線性關(guān)系。

如果上述表型拯救實(shí)驗(yàn)失敗，很有可能說明藥物存在非靶點(diǎn)效應(yīng)。但是，我們需要知道，成功逆轉(zhuǎn)某些表型可能還需要滿足其他條件，比如導(dǎo)入的外源靶點(diǎn)必須達(dá)到內(nèi)源靶點(diǎn)的豐度，并符合生理調(diào)控過程（例如細(xì)胞周期特異性調(diào)控）。解決這個(gè)問題（至少在蛋白質(zhì)豐度方面）的一種方法是，將外源靶點(diǎn)基因置于可調(diào)控的啟動(dòng)子之下，然后使用CRISPR-Cas9刪掉內(nèi)源靶點(diǎn)表達(dá)。另一種方法是用含有靶基因順式作用調(diào)節(jié)元件的細(xì)菌人工染色體(BACs)進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)。

在表型拯救實(shí)驗(yàn)中，為了明確表型與靶點(diǎn)的因果關(guān)系，排除非靶點(diǎn)效應(yīng)，有必要使用多種試劑進(jìn)行檢測(cè)，比如用多個(gè)獨(dú)立的shRNAs或用化學(xué)試劑對(duì)遺傳試劑進(jìn)行補(bǔ)充。使用不同種類的試劑得到互相佐證的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，或者通過動(dòng)物模型加強(qiáng)細(xì)胞模型的結(jié)果，會(huì)讓癌癥靶點(diǎn)驗(yàn)證研究更具說服力。

此外，更合理地設(shè)計(jì)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，對(duì)解釋證明藥靶的因果關(guān)系也非常重要。

癌癥靶點(diǎn)研究的一大挑戰(zhàn)是確定臨床可耐受的最終藥物劑量，達(dá)到抑制腫瘤生長、理想情況下消退腫瘤的目的。為此，人們常用到腫瘤異種移植實(shí)驗(yàn)，而這類實(shí)驗(yàn)中常被忽視的一點(diǎn)就是用藥的時(shí)機(jī)。

在腫瘤細(xì)胞移植之前、移植時(shí)或移植后立刻應(yīng)用藥物，都可能會(huì)高估藥物靶點(diǎn)在腫瘤維持中的作用。例如，注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi)的10⁶個(gè)腫瘤細(xì)胞必須經(jīng)過至少10次倍增才能達(dá)到1cm³的荷瘤大小，如果用藥時(shí)機(jī)過早，使細(xì)胞增殖變緩，那么同一時(shí)間段內(nèi)細(xì)胞的9次倍增就能讓荷瘤生長減少50%，而這一“好”結(jié)果其實(shí)是夸大的。

因此，理想情況下，應(yīng)在已建好的荷瘤模型上使用藥物，尤其是腫瘤轉(zhuǎn)移模型。

另外需要注意的是，在免疫缺陷小鼠中引起腫瘤生長停滯的藥物，在免疫正常小鼠中，可能會(huì)使腫瘤發(fā)生消退。

新的癌癥靶點(diǎn)藥物的發(fā)現(xiàn)常因潛在的毒性而被批評(píng)或否認(rèn)，比如該靶點(diǎn)對(duì)維持正常胚胎發(fā)育或成年個(gè)體的生理功能很重要等。但這種論點(diǎn)有不妥之處，因?yàn)椋?/span>

針對(duì)癌癥靶點(diǎn)的新藥物常常被批評(píng)或者否定，因?yàn)樗赡芫哂袧撛诘亩拘浴１热?，該靶點(diǎn)對(duì)維持正常胚胎發(fā)育或成年個(gè)體的生理功能很重要，而藥物可能會(huì)導(dǎo)致胚胎不能正常發(fā)育，或破壞人體的生理功能……等。但這種論點(diǎn)有不妥之處，因?yàn)椋?/span>

首先，新靶點(diǎn)在胚胎發(fā)育中的功能不一定代表成年個(gè)體中的情況，而且藥物一般只是使靶蛋白功能失活，這與敲除該基因是不同的，因此將靶點(diǎn)的遺傳功能用于判斷化學(xué)藥靶的毒性是會(huì)誤導(dǎo)人的。其次，化學(xué)藥物的劑量可以控制在一定范圍，在達(dá)到治療效果的同時(shí)避免產(chǎn)生毒性。最后，藥物代謝存在物種差異，很多在動(dòng)物模型中觀察到毒性的藥物，在人體內(nèi)卻觀察不到。

未來抗癌藥物的研發(fā)依賴于藥物靶點(diǎn)的識(shí)別和驗(yàn)證，因此相關(guān)研究的可重復(fù)性和可靠性非常重要，應(yīng)當(dāng)鼓勵(lì)研究者發(fā)布詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)、增進(jìn)數(shù)據(jù)共享，這方面的原則和指南也已經(jīng)出臺(tái)（比如NIH Principles and Guidelines for Reporting Preclinical Research和The Reproducibility Project: Cancer Biology）。另外，學(xué)術(shù)期刊總是傾向于發(fā)表那些陽性結(jié)果或前后一致的論文，造成研究者有意無意地對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行挑選。然而，我們應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，發(fā)表論文只是推進(jìn)科研的手段，而不是目的。發(fā)表錯(cuò)誤的或不可靠的論文既浪費(fèi)了資源，也阻礙了科研進(jìn)展。我們需要的是能夠經(jīng)得起時(shí)間檢驗(yàn)的優(yōu)秀研究。盡管高標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)定意味著更多挑戰(zhàn)，但只有這樣，我們才能更有效地推進(jìn)抗癌研究，惠及千秋。