16S rDNA測序結(jié)果分析

追著天使拔毛 2019-10-09

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2017-12-13

1.測序結(jié)果文件

一般公司DNA測序結(jié)果都提供兩個文檔，一個是序列文檔(后綴為.seq)，一個是測序峰圖文檔(后綴.ab1)，為堿基的測序質(zhì)量信息。
(A).seq – 序列文件，TEXT的序列文檔，可由記事本或BioEdit打開。
(B).ab1－峰圖文件，可由BioEdit或Chromas打開察看。

2.切除兩端低質(zhì)量堿基

由于Sanger測序技術(shù)限制，每個測序反應(yīng)一般僅有800bp左右比較準確。
一般測序結(jié)果的前端大約50個堿基的質(zhì)量會不好(測序引物的原因)，此部分測序峰圖通常無法判讀。這是正?，F(xiàn)象，需要把此部分堿基切除。同理，測序后期的堿基質(zhì)量也比較差(酶活降低與雜質(zhì)干擾較大等原因)，也需要把尾部測序峰圖不規(guī)則的堿基切除。因此留下中間堿基質(zhì)量相對較好(峰圖規(guī)則)的序列用于后續(xù)分析。方法如下：

用 BioEdit 打開正向測序結(jié)果峰圖文件( ZB10100433 (yangpin1) 16SS(zidai)_Pw_G12.ab1),通過移動左邊與左上角的比例標尺，調(diào)整峰圖的高度與寬度，使DNA每個堿基的峰圖大小適合觀察。
從下圖看出，前面50多個堿基的峰較亂，此處選擇55個開始的堿基。同理，DNA末端由于酶活力下降等原因，測序質(zhì)量也逐步變差。根據(jù)峰圖的形狀，我們也需要切除尾部950bp后的堿基（約末端100bp），只保留56-950之間約900bp的高質(zhì)量堿基。
選擇 BioEdit 顯示DNA序列的子窗口(Window菜單->DNA sequence frome…)
然后在 BioEdit 的Sequence菜單->select positions,在彈出窗口中輸入56與950，點OK按鈕后，就以背景黑的顯示已選擇的序列。
再選edit菜單->Copy(或直接按Ctrl-C鍵)，復(fù)制序列到一個新的文本文件，保存為16S_rDNA.fas。增加序列的注釋行”>16SF”,代表正向測序序列。
同上步驟，根據(jù)峰圖信息，再復(fù)制另一個反向測序結(jié)果的高質(zhì)量序列(56-950)到文本文件16S_rDNA.fas，并標記序列為”>16SR”，代表反向測序序列。
DNA測序通常需要兩個方向進行，測序都是從DNA的5’端到3’端進行的，正向和反向測序是指對DNA的兩條互補鏈分別測序。雙向測序結(jié)果經(jīng)校讀后完全一致才能認為得到可靠DNA測序結(jié)果。

3.雙向測序序列的合并

通常PCR產(chǎn)物雙向測序，需要合并雙向序列，最終得到全長序列，這樣得到DNA序列比較準確。

Bioedit打開前面保存的16S_rDNA.fas。
由于第二條序列是反向測序得到的DNA反向互補序列，需要通過先得到DNA的反向互補序列：Sequence->Nuleic Acid->Reverse Complement，再進行比對。
利用BioEdit的alignment功能找重疊區(qū)域:Accessory application->ClustalW multiple alignment，使用默認設(shè)置，比對結(jié)果顯示，中間重疊部分的序列大部分相似。
如果重疊區(qū)不是大部分相同堿基，請試著把一條序列反向互補，再比對。

4.堿基的校準

在上一步的比對結(jié)果窗口，先利用BioEdit得到兩條件序列合并后的一致序列：

Alignment菜單->Create Consensus Sequence。
如是中間重疊區(qū)有少部分堿基不一致，可根據(jù)對應(yīng)的峰圖文件ab1的質(zhì)量信息，修改堿基。

修改堿基前，需要先把bioedit的Mode設(shè)置為”Edit”與”Insert”，并選中按鈕”view conservation plotting identities […] with a dot”，以點顯示相同的堿基，便于觀察差異位點。

在BioEdit中打開正向和反向測序結(jié)果的AB1文件和上面比對結(jié)果放同一窗戶(如圖)。
定位到差異堿基的位置（下圖黑色部分），一般可以在峰圖文件中查找不一致堿基（正反鏈錯配、缺失或誤增堿基）及附近的幾個序列（點擊Edit菜單->find，或直接Ctrl-F），如查找GCAtAC。
注意反向測序峰圖的搜索，需要輸入序列的反向互補序列（GTtTGC）,小寫字母為不一致堿基。
查看該堿基及附近堿基正反測序峰圖形狀，判斷該堿基正確的堿基序列。
然后在序列窗口中分別改正正向16SF、反向16SR及Consensus序列中不一致的堿基。如有空格(gap)顯示為”-“，需要把三條序列同一位置上的堿基與”-“都刪除，才能保持后面的堿基比對結(jié)果正常(Backspace可刪除光標前一個堿基)。

在BioEdit中打開正向和反向測序結(jié)果的AB1文件和上面比對結(jié)果放同一窗戶(如